Cibler Enterococcus faecalis HMG

Communications Biology volume 6, Article number: 360 (2023) Citer cet article

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L'HMG-CoA réductase (HMGR), une enzyme limitant la vitesse de la voie du mévalonate chez les bactéries pathogènes à Gram positif, est une cible attrayante pour le développement de nouveaux antibiotiques. Dans cette étude, nous rapportons les structures cristallines de HMGR d'Enterococcus faecalis (efHMGR) sous les formes apo et ligaturée, mettant en évidence plusieurs caractéristiques uniques de cette enzyme. Les statines, qui inhibent l'enzyme humaine avec une affinité nanomolaire, fonctionnent mal contre les homologues bactériens du HMGR. Nous rapportons également un puissant inhibiteur compétitif (Chembridge2 ID 7828315 ou composé 315) de l'enzyme efHMGR identifié par un criblage in vitro à haut débit. La structure cristalline aux rayons X de efHMGR en complexe avec 315 a été déterminée à une résolution de 1, 27 Å, révélant que l'inhibiteur occupe le site de liaison au mévalonate et interagit avec plusieurs résidus de sites actifs clés conservés parmi les homologues bactériens. Surtout, 315 n'inhibe pas le HMGR humain. Notre identification d'un inhibiteur sélectif, non statine, des HMG-CoA réductases bactériennes jouera un rôle déterminant dans l'optimisation et le développement de nouveaux candidats-médicaments antibactériens.

La résistance aux antibiotiques des bactéries pathogènes est une menace pressante pour la santé humaine dans le monde entier. Au cours des dernières années, plusieurs bactéries Gram-positives, dont Staphylococcus aureus, ont acquis une résistance à plusieurs antibiotiques par des événements de transfert latéral de gènes d'Enterococcus1,2 rendant leur gestion clinique difficile. La prévalence de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) et d'entérocoques résistants à la vancomycine (ERV) est un problème de santé publique majeur car les infections causées par ces bactéries résistantes aux antibiotiques sont associées à des taux élevés de morbidité et de mortalité3. Les antibiotiques actuellement sur le marché ou en cours d'approbation sont soit des variantes des anciennes classes, soit ciblent les mêmes voies moléculaires et deviennent ainsi la proie de ces mêmes mécanismes de résistance. L'identification de cibles moléculaires alternatives est une nécessité pour vaincre cette résistance.

La voie du mévalonate est une cible attrayante pour la conception de ces nouveaux antibactériens. Il consiste en une série d'enzymes qui prennent trois équivalents d'acétyl-CoA et une séquence de divers cofacteurs pour produire du diphosphate d'isopentényle via un intermédiaire mévalonate. L'isopentényl diphosphate (IPP) est le composant métabolique central des isoprénoïdes qui sont impliqués dans de nombreuses fonctions métaboliques à travers le spectre biologique4,5. Chez les bactéries, l'IPP produit de l'undécaprénol, impliqué dans la biosynthèse de la paroi cellulaire des peptidoglycanes6, des ubiquinones et des ménaquinones pour la chaîne de transport d'électrons ainsi que des caroténoïdes dont la staphyloxanthine chez S. aureus7.

La nécessité de la voie du mévalonate dans la survie des bactéries Gram-positives à faible teneur en G + C, notamment S. aureus8, Enterococcus faecalis et Streptococcus pneumoniae9 a suscité plusieurs recherches sur la voie en tant que cible possible pour le développement d'un nouvel antibiotique. Il convient de noter que toutes les bactéries Gram-négatives et autres bactéries Gram-positives ne produisent pas d'IPP via la voie du mévalonate. Plusieurs espèces bactériennes, dont Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori et Bacillus subtilis, utilisent la voie non mévalonate 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate/2-C-méthyl-D-érythritol 4-phosphate (DOXP/MEP)10,11. Ainsi, un inhibiteur de la voie du mévalonate ciblerait spécifiquement les coques à faible teneur en G + C à Gram positif, y compris les bactéries pathogènes majeures qui dépendent de cette voie, sans affecter la flore intestinale normale de l'hôte, une approche reconnue comme importante pour la santé humaine et la guérison12.

L'HMG-CoA réductase (HMGR) catalyse la réduction à quatre électrons du (S)-HMG-CoA en (R)-mévalonate, qui est l'étape limitant la vitesse de la voie du mévalonate13. Il a également été démontré que le HMGR est l'une des enzymes de la voie du mévalonate essentielles à la survie des bactéries pathogènes et constitue donc une cible attrayante pour la conception d'inhibiteurs14. L'alignement des séquences et les structures 3D révèlent deux classes évolutives divergentes de HMGR avec des homologues eucaryotes et la plupart des archéens regroupés en enzymes de classe I et les homologues bactériens et quelques archéens en enzymes de classe II. De plus, les différences substantielles dans l'architecture du site actif entre les homologues humains et bactériens, qui se reflètent par la différence d'inhibition de 104 fois par les statines, un médicament hypocholestérolémiant, permettent la conception d'un inhibiteur spécifique des enzymes bactériennes14,15.

Dans cette poursuite, nous rapportons la structure cristalline de la cible, la HMG-CoA réductase sous forme apo (Ref-apo), et en complexe avec les ligands HMG-CoA, le mévalonate et le cofacteur NADP+ (Ref-ternaire), de la bactérie pathogène E. faecalis. En outre, un vaste criblage in vitro a été entrepris à la recherche de petites molécules inhibitrices de cette enzyme qui ont identifié un composé principal avec une IC50 dans la gamme micromolaire inférieure. Enfin, la structure cristalline (Ref-315) de cet inhibiteur (Chembridge2 ID 7828315) lié à l'enzyme E. faecalis HMG-CoA réductase (efHMGR) a été résolue, détaillant le mécanisme moléculaire de l'inhibition et jetant les bases d'une future recherche sur la conception de médicaments basée sur la structure.

Les trois premières étapes de la voie du mévalonate impliquent les enzymes acétoacétyl-CoA thiolase, HMG-CoA synthase et HMG-CoA réductase. L'acétoacétyl-CoA thiolase catalyse la condensation de deux molécules d'acétyl-CoA pour produire de l'acétoacétyl-CoA. L'HMG-CoA synthase catalyse la condensation de l'acétyl-CoA avec l'acétoacétyl-CoA pour former l'HMG-CoA. L'HMG-CoA réductase catalyse alors la conversion de l'HMG-CoA en mévalonate14. La réaction directe est entraînée par le NADPH et le HMG-CoA tandis que la réaction inverse par le CoA-SH, le mévalonate et le NADP+. Le produit du gène mvaE dans E. faecalis code pour une protéine de fusion qui abrite deux fonctions catalytiques distinctes16. Le domaine N-terminal (1-378) abrite l'activité acétoacétyl-CoA thiolase tandis que le domaine C-terminal contient l'activité HMG-CoA réductase. Pour notre étude, ce domaine C-terminal (résidus 381-803) a été cloné à partir du gène de pleine longueur dans le laboratoire du professeur Victor Rodwell à Purdue17.

L'HMG-CoA réductase d'E. faecalis (efHMGR) sous forme apo et ligaturée a été exprimée, purifiée et cristallisée (Méthodes). Les structures cristallines de l'apo et des enzymes liées au ligand ont été résolues à 2,25 Å et 2,27 Å respectivement. Les structures résultantes suivent l'architecture globale des homologues bactériens publiés précédemment18,19,20,21. En bref, efHMGR est un dimère obligatoire et entrelacé avec les deux sites actifs composés de composants de chacun des monomères (Fig. 1a). Afin de distinguer les résidus provenant de différents monomères/chaînes, l'ID de chaîne est écrit entre parenthèses à côté du résidu. Par exemple, Asn-184 (A) signifie que le résidu Asn-184 provient de la chaîne/du monomère A. Chaque monomère est constitué de trois domaines : un grand domaine (résidus 1-108 et 212-370) qui lie HMG-CoA dans une conformation étendue, un petit domaine (résidus 109-211), composé d'un domaine non classique de liaison aux nucléotides de Rossmann qui interagit avec NADP+/NADPH, et enfin un domaine de lambeau C-terminal (résidus 371-423) qui comprend les 53 derniers résidus du monomère (Fig. 1b). Dans les homologues bactériens de classe II14, le domaine du lambeau a une architecture persistante à 3 faisceaux hélicoïdaux qui interagit dynamiquement avec le corps de la protéine au fur et à mesure que la réaction se déroule18,20.

a La structure du dimère apo efHMGR : deux monomères interagissent de manière complexe pour former le dimère biologiquement actif, coloré respectivement en vert et en bleu. Le domaine N-terminal qui est permuté est indiqué par un carré rouge. b Dans le dimère efHMGR ligaturé, le domaine volet (orange) se ferme lors de la liaison de HMG-CoA et NADP+ (représenté par des bâtons bleus et jaunes). HMG-CoA interagit principalement avec le grand domaine d'un monomère (vert) et NADP+ interagit avec le petit domaine (bleu) de l'autre monomère. c La boucle ENQISX3VP, unique dans efHMGR, participe à diverses interactions au point de croisement. Les résidus en interaction (Gln-39, Phe-40, Asn-42, Ala-44, Leu-45, Gln-57, Ile-58, Ser-59, Glu-60, Glu-62 et Lys-332) sont représentés en bâtonnets. Les liaisons H sont représentées par des lignes pointillées rouges et les distances sont indiquées en Å. d La boucle ENVIG dans pmHMGR (vert) et DaHMGR (rouge) montrée dans la représentation de bande dessinée suggèrent que la présence d'un résidu proline précédant cette boucle ainsi que d'autres résidus hydrophobes tels que Met-44, Ala-47 et Val-54 empêchent un échange de domaine complet. Le partenaire dimère est représenté en cyan. La "boucle ENQIS" de efHMGR (gris) est indiquée comme référence. e L'alignement de séquences multiples d'efHMGR avec des séquences HMGR de classe II de S. pneumoniae, S. aureus, P. mevalonii, Listeria monocytogenes, Delftia acidovorans, E. faecium, E. hirae montre que la boucle ENQIS (en rouge) est unique à Enterococcus.

Bien que l'unité asymétrique des deux formes cristallines (Ref-apo et Ref-ternaire) consiste en un tétramère disposé en dimère de dimères (AB et CD), l'interface dimère-dimère n'est pas conservée. Dans la structure de l'apoenzyme, le contact dimère-dimère est principalement médié par un ion calcium donné par l'acétate de calcium dans l'état de cristallisation. Dans le complexe lié au ligand, un ensemble différent de contacts induits par les cristaux est observé à l'interface dimère-dimère impliquant le domaine du volet. Étant donné que l'interface dimère-dimère est assez petite et n'est pas conservée sous différentes formes, elle est probablement une conséquence de l'emballage cristallin et n'a aucune pertinence biologique (Fig. 1 supplémentaire et note supplémentaire 1).

Un échange de domaine est un mécanisme de formation d'oligomères dans lequel les monomères échangent des éléments structuraux similaires entre eux, conduisant à un assemblage d'ordre supérieur22. L'étendue de l'échange peut aller d'un seul élément structurel secondaire à tout un domaine tertiaire. Le rôle biologique d'un échange de domaine peut être de fournir un mécanisme pour réguler la fonction des protéines, ainsi qu'une stratégie évolutive pour former des complexes protéiques stables22,23. L'HMG-CoA réductase existe sous des formes dimères ou oligomères supérieures19 à travers les espèces avec des enzymes qui démontrent différentes étendues d'échange de domaine du sous-domaine N-terminal (résidus 1-65)15,19,21. Dans les structures de classe I publiées des homologues humains24 et archéaux25, le sous-domaine entier se replie contre, traverse et interagit principalement avec le domaine C-terminal du monomère adjacent. Cependant, dans toutes les réductases procaryotes de classe II résolues jusqu'à présent, seuls 16 résidus autour de l'élément de dimérisation ENVXGX3I/L/VP (résidus 46-61) sont échangés, tandis que le reste du sous-domaine N-terminal se replie sur lui-même et interagit avec le domaine C-terminal du même monomère21,25,26. HMGR d'E. faecalis s'avère être une exception. Bien qu'il s'agisse d'un HMGR de classe II classique, l'ensemble de son domaine N-terminal (résidus 1 à 65) subit un échange de domaine complet autour de la région charnière (résidus 42 à 45) et interagit avec le domaine principal de son partenaire dimère (Fig. 1a, c) et, ce faisant, ressemble aux homologues de classe I (Fig. 2 supplémentaire).

Plusieurs facteurs affectent l'étendue de l'échange de domaine dans les protéines, notamment la présence de résidus de proline ainsi que la flexibilité et la longueur de la région charnière autour de laquelle le domaine s'échange27. Nos données suggèrent que «l'élément de dimérisation» entre αC et βA dans efHMGR, qui forme une feuille β avec le monomère adjacent, joue un rôle important dans l'échange de domaine. De manière unique, l'élément susmentionné contient une séquence ENQ57IS59X3VP avec des substitutions glutamine et sérine (soulignées) pour la valine et la glycine, autrement présentes dans la plupart des autres homologues bactériens (Fig. 1e). Les trois structures efHMGR rapportées ici suggèrent que Gln-57, Ser-59 (dans la boucle ENQIS) et Glu-60 (résidu X) effectuent plusieurs interactions, ce qui stabilise ce croisement (Note complémentaire 2). Les interactions de liaison hydrogène (liaison H) entre Phe-40, Asn-42, Ala-44, Leu-45, Gln-57, Ser-59, Glu-60, Glu-62 d'un monomère et Lys-332 de l'autre monomère (de la paire de dimères), autour du point de croisement, stabilisent l'échange de domaine (Fig. 1c).

Dans d'autres enzymes HMGR procaryotes de Pseudomonas mevalonii (pmHMGR, PDB : 4i64)20, S. pneumoniae (SpHMGR, PDB : 5wpj)18, Delftia acidovorans (DaHMGR, PDB : 6eeu)26 et Burkholderia cenocepacia (BcHMGR, PDB : 6p7k)19, la séquence ENQIS est remplacée par la Séquence ENVXG qui ne fait pas de telles interactions (Fig. 1d et Note complémentaire 2).

Cette différence dans l'échange de domaine dans la structure efHMGR pourrait avoir une signification fonctionnelle dans les interactions avec le domaine fusionné de l'acétoacétyl-CoA thiolase. Dans ce contexte, l'efHMGR est similaire au HMGR humain de classe I qui possède également un grand domaine traversant la membrane N-terminal responsable de la dégradation rapide de l'enzyme28. Pour efHMGR, la stabilité du dimère peut être le rôle fonctionnel du swap. Les homologues d'E. faecium et d'E. hirae, qui codent pour la protéine de fusion avec l'activité acétoacétyl-CoA thiolase et réductase dans un seul polypeptide14,16, affichent également la séquence "ENQI/VS" (Fig. 1e).

Le site actif présent à l'interface dimère de efHMGR est une rainure ouverte qui forme une forme de V le long de la surface de la molécule. Un bras du V abrite HMG-CoA tandis que l'autre NADP+. La structure complexe ternaire montre que HMG-CoA se lie au grand domaine d'un monomère et NADP + au petit domaine de l'autre monomère (Figs. 1b et 2a). Au point du V, les deux monomères rassemblent les ligands dans une poche plus profonde qui lie les six carbones HMG ou mévalonate. Cet arrangement positionne le carbone carbonyle du thioester HMG-CoA à proximité de l'atome C4 du cycle nicotinamide du NADPH pour le transfert d'hydrure. Une comparaison du site actif efHMGR avec d'autres enzymes HMGR procaryotes publiées (écart rms ~ 0, 1–0, 3 Å) suggère qu'il s'agit d'un site actif hautement conservé avec des interactions similaires observées entre les ligands et les résidus enzymatiques. La triade catalytique de Glu-86, Lys-263 et Asp-279 est disposée autour de l'oxygène carbonyle du thioester, prête à stabiliser la charge négative en développement de l'intermédiaire et à fournir l'hydrogène pour la conversion finale du mévaldéhyde en mévalonate29. Les interactions entre l'enzyme et les ligands, HMG-CoA, mévalonate et NADP + sont détaillées dans la section supplémentaire (Fig. Supplémentaire 3a – c).

une carte de potentiel de surface électrostatique de efHMGR avec NADP + et HMG-CoA liés dans le site actif. HMG-CoA (vert) et NADP+ (jaune) sont représentés sous forme de bâtons. b Les résidus Tyr-146, Ser-148 et Arg-152 représentent les déterminants moléculaires présents dans le petit domaine de efHMGR qui interagissent avec les atomes d'oxygène du groupe 2'-ribose-phosphate de NADP+. Le Gln-410 provenant du lambeau interagit également avec le NADP+. La molécule NADP+ est enfermée dans une densité de différence 2Fo-Fc à 1,0σ. Les interactions des liaisons hydrogène sont représentées par des tirets rouges et les distances sont indiquées en Å. c Les HMGR de classe II de S. pneumoniae, S. pyogenes, S. aureus et E. faecalis utilisent le NADPH comme cofacteur. Les résidus (marqués d'un astérisque) qui déterminent la spécificité du cofacteur sont conservés dans ces enzymes bactériennes, y compris efHMGR. Le HMGR de P. mevalonii, qui utilise le NADH, a Asp-146, Leu-148 et Leu-152 comme déterminants moléculaires.

Le domaine de lambeau (résidus 371-421) se ferme lors de la liaison du ligand, recouvrant le site actif et amenant l'His-376 catalytique en position. La région charnière précédant le domaine du volet dans efHMGR (résidus 368-370) subit un changement conformationnel substantiel lors de la liaison du ligand. Dans l'apoenzyme Glu-370, le dernier résidu de la charnière est partiellement désordonné. Cependant, lors de la liaison du ligand, le squelette de Glu-370 se réoriente (ΔΦ = -78,1 ° ΔΨ = -12,9 °) de sorte que le groupe carboxyle de la chaîne latérale de Glu-370 crée des interactions de pont salin avec le groupe guanidinium de Arg-365. Glu-370 se connecte en outre à la fraction diphosphate de HMG-CoA via une interaction de liaison hydrogène médiée par l'eau. Le groupe guanidino d'Arg-365 interagit avec l'oxygène carbonyle de la fraction pantothénique de HMG-CoA par l'intermédiaire d'une molécule d'eau. De plus, Glu-370 interagit avec les résidus suivants, Gly-371 et Gly-375 présents dans la première hélice du lambeau via une molécule d'eau (Fig. 4 supplémentaire). L'interaction du pont salin entre Arg-365 et Glu-370 est unique à efHMGR et est observée chaque fois que le volet est commandé, ce qui suggère qu'il pourrait être important pour la fermeture du domaine du volet. Ces résidus, bien que présents dans pmHMGR, ne s'engagent pas dans de telles interactions dans les structures à volets fermés (PDB : 1qax, 4i4b).

Dans la structure complexe ternaire de efHMGR, chacun des dimères (AB et CD) de l'unité asymétrique abrite deux sites actifs pour un total de quatre. Le NADP+ est présent dans tous les sites actifs et l'HMG-CoA dans un seul où la combinaison de l'HMG-CoA et du NADP+ forme une combinaison non active de ligands. Une densité compatible avec le mévalonate est également trouvée dans l'un des sites actifs. Ce n'est pas une observation rare, car l'HMG-CoA est connu pour subir une réduction spontanée en mévalonate en raison des dommages causés par les radiations (PDB : 1r31)20.

Le NADH sert de coenzyme pour les processus oxydatifs qui produisent de l'ATP, tandis que le NADPH sert de coenzyme pour les réactions de biosynthèse réductrices. Par rapport au NADH, le NADPH abrite un groupe phosphate sur le groupe 2'-hydroxyle du fragment ADP-ribose, qui sépare ces deux pools d'agents redox. L'analyse de plusieurs déshydrogénases contenant le domaine classique de liaison aux dinucléotides de Rossmann suggère qu'une boucle contenant une empreinte GXGXXG/A facilite la liaison de l'enzyme à la fraction adénine-ribose de NADH/NADPH30. Cependant, la sélection de NADPH vs NADH semble dépendre des résidus entourant cette séquence consensus et varie entre les différentes familles de déshydrogénases.

La spécificité de l'enzyme HMGR vis-à-vis du NADH ou du NADPH diffère entre les deux classes. Alors que les homologues eucaryotes de classe I utilisent exclusivement le NADPH, les homologues procaryotes de classe II peuvent utiliser le NADH ou le NADPH. La réductase de classe II d'Archaeoglobus fulgidus peut exploiter les deux cofacteurs31, mais le pmHMGR est hautement sélectif vis-à-vis du NADH32 et les enzymes de S. pneumoniae, S. aureus et E. faecalis sont spécifiques vis-à-vis du NADPH16. En fait, l'efHMGR n'a montré aucune activité lorsque le NADH a été utilisé et un excès de NADH multiplié par dix par rapport au NADPH n'a pas pu inhiber la réaction16.

Les homologues comme pmHMGR, qui sont spécifiques du NADH, ont un acide aminé chargé négativement, un résidu aspartate invariant (Asp-146) sur une courte hélice alpha (hélice αF) dans le petit domaine qui interagit avec le groupe 2'- et 3'-hydroxyle de la fraction adénine-ribose. Friesen et al.33 ont réussi à améliorer la spécificité relative de l'enzyme pmHMGR vis-à-vis du NADPH en mutant Asp-146 en Ala et en introduisant un résidu chargé positivement (Arg) à la place du Leu-148 voisin. Ces observations les ont amenés à émettre l'hypothèse qu'un petit résidu à cette position fournirait un espace supplémentaire pour la fraction phosphate et qu'un résidu chargé positivement à proximité neutraliserait la charge négative sur le phosphate33.

La superposition structurelle de l'enzyme pmHMGR (PDB : 1qax) sur efHMGR, liée à leurs cofacteurs NAD/P respectifs, montre qu'au lieu de sélectionner une chaîne latérale plus petite en position 146 pour faire de la place au phosphate, un résidu de tyrosine volumineux et volumineux (Tyr-146) a été sélectionné dans efHMGR. Cela force l'adénine-ribose-phosphate à un angle proche de 90 ° par rapport à la structure de P. mevalonii. Le groupe hydroxyle de la chaîne latérale de Tyr-146 (D) a ensuite des liaisons hydrogène avec l'oxygène adénine-ribose-phosphate (O2X). Le résidu suivant dans efHMGR est Pro-147 (D), qui introduit une courbure dans l'hélice alpha, amenant ainsi le résidu suivant, Ser-148 (D) à la distance de liaison hydrogène de l'oxygène adénine-ribose-phosphate (O3X) (Fig. 2b). Les deux résidus équivalents dans pmHMGR sont Gln-147 et Leu-148, dont aucun ne peut interagir avec les hydroxyles du ribose. Le changement final est le résidu Leu-152 dans P. mevalonii, qui établit un contact VDW avec la base adénine (3,6 Å) et est remplacé par un résidu Arginine (Arg-152) dans E. faecalis. Arg-152 (D) forme une interaction d'empilement avec la base adénine (3, 5 Å) et également des liaisons hydrogène avec l'oxygène ribose-phosphate (O3X) de NADP + (Fig. 2b). Ces quatre changements (D146Y, Q147P, L148S et L152R) sont conservés dans les séquences alignées HMGR staphylococcique, entérocoque et streptocoque (Fig. 2c).

La structure précédemment publiée de SpHMGR (PDB: 5wpj) 18 a rapporté les interactions entre les oxygènes ribose-phosphoryle du NADPH et les résidus Ser et Arg analogues, et a suggéré que Tyr-144 (analogue à Tyr-146 dans efHMGR) éloigne le fragment adénosine afin que les oxygènes ribose-phosphoryle puissent se lier avec Ser-146 (analogue à Ser-148 dans efHMGR) 1 8. Notre structure cristalline efHMGR montre que Tyr-146 remplit un double rôle et non seulement force le ribose-phosphate à interagir avec Ser-148 et Arg-152, mais en même temps des liaisons hydrogène avec l'oxygène ribose-phosphoryle de NADP + (O2X). De plus, dans efHMGR, le groupe amide de la chaîne principale de Gln-410 (C), présent dans la boucle entre la 2ème et la 3ème hélice du domaine de volet est à une distance potentielle de liaison hydrogène (3, 4 Å) de l'oxygène ribose-phosphate de NADP + (O3X). Une interaction médiée par l'eau est observée entre le fragment adénine-3'-ribose-hydroxyle et le groupe carboxamide de chaîne latérale de Gln-410. (Fig. 2b). Ces interactions n'ont pas été observées dans le SpHMGR car les volets de ces structures étaient positionnés dans une configuration ouverte éloignée du site actif18.

Dans les enzymes HMGR, le domaine de lambeau C-terminal qui se ferme sur le site actif lors de la liaison du ligand joue un rôle crucial dans la catalyse. Chez les homologues de Classe I (archéaux et eucaryotes)34, il est relativement court et se compose uniquement de la première hélice du plus grand faisceau à trois hélices caractéristique des enzymes bactériennes de Classe II15. Bien que la signification de ce domaine de lambeau plus large ne soit pas claire, les structures cristallines publiées démontrent que le faisceau bactérien à trois hélices subit plusieurs réarrangements conformationnels lors de l'entrée, de la sortie et de la catalyse du ligand18,20,32 (Note complémentaire 3).

Il existe un accord sur un schéma général pour les étapes du mécanisme de réaction complexe catalysé à la fois par les réductases HMG-CoA humaines et bactériennes. Initialement, la liaison à la fois de HMG-CoA et de NADH/NADPH induit l'ordre et la fermeture du domaine des volets sur le site actif. Ensuite, le thioester de HMG-CoA est réduit par le premier transfert d'hydrure et l'oxyanion résultant est stabilisé par Glu-83 et Lys-267 catalytiques (nomenclature pmHMGR). Les premières études ont démontré que le thiohémiacétal résultant est l'intermédiaire prédominant bien qu'il soit en équilibre dynamique avec l'aldéhyde et le thioanion35,36. Le domaine du volet change de configuration, ce qui permet la libération du NAD+/NADP+ oxydé. Cela conduit à la liaison d'une autre molécule de NADH/NADPH suivie d'une réduction rapide de l'aldéhyde en le produit, le mévalonate assisté par le Glu-83 catalytique. Le catalytique His-381 donne un proton au thioanion formant le second produit CoA-SH. Le volet change à nouveau de configuration permettant la sortie de ces produits et du deuxième NAD+/NADP+ oxydé. Les détails de certaines de ces étapes ont été confirmés dans des études récentes de dynamique moléculaire29.

La structure ligandée efHMGR (Ref-ternaire) rapportée ici suggère que le lambeau est désordonné lorsque NADP+ seul est présent dans le site actif. Dans ces structures, une combinaison soit de HMG-CoA + NADP+ soit de mévalonate + NADP+ doit être présente pour que le volet se ferme. (Fig. 3a–c). Cependant, un examen plus approfondi indique que le domaine du volet a une conformation différente (écart rms de Cα ~ 1, 4 Å) dans ces deux combinaisons de ligands (Fig. 3d). Avec le mévalonate et le NADP+ dans le site actif (Dimer CD), le domaine de lambeau est vu dans la conformation entièrement fermée avec His-376 (C) à distance de la liaison hydrogène du Ser-88 catalytique (D). La carte de densité électronique 2Fo-Fc montre une molécule NADP+ bien ordonnée avec des facteurs B comparables aux résidus environnants. Le groupe carboxamide des liaisons hydrogène du cycle nicotinamide avec la chaîne latérale de l'Asn-213 (D). De plus, le groupe carboxamide de l'Asn-184 (D) se lie à l'hydrogène (3,1 Å) avec le nicotinamide ribose-oxygène et bloque le cofacteur dans le site actif. Plusieurs interactions de liaison hydrogène directes et médiées par l'eau relient le cofacteur au domaine volet de l'enzyme. Alors que les liaisons hydrogène nicotinamide-ribose 2'-OH avec l'Asn-279 (C) (2,9 Å) du grand domaine, le nicotinamide-ribose 3'-OH interagit également avec le catalytique His-376 (C) via une molécule d'eau bien ordonnée et à liaisons H multiples (His-376 (2,9 Å), Gln-380 (C) (2,8 Å), ribose-3'- OH (2,9 Å) et Asn-184 (D) (3,0 Å)). Un tour plus loin dans cette hélice, Gln-380 (C) se connecte davantage à Glu-85 (C) via deux liaisons hydrogène médiées par l'eau. Ce réseau d'interactions sert à maintenir l'His-376 catalytique près de Ser-88 et la fraction thioester de HMG-CoA (Fig. 3e). Comme on le voit dans d'autres réductases bactériennes, plus bas dans la première hélice du domaine du lambeau, Met-386 (C) s'engage dans des interactions hydrophobes avec Met-53 (D) et Val-329 (D) et médie l'interaction avec le corps principal de l'enzyme. Dans les structures complexes ternaires publiées de pmHMGR (PDB : 4i4b, 1qax)20,32, un NAD+ bien ordonné facilite également des interactions similaires avec His-381 et maintient le domaine du volet dans une conformation entièrement fermée. Miller et al.18 ont observé que dans la structure SpHMGR liée à l'apo-SpHMGR et au NADPH, le lambeau est ordonné mais adopte une conformation ouverte. Dans cette conformation, le lambeau est éloigné du site de liaison du substrat et du cofacteur18. Leur observation est différente à la fois de efHMGR et de pmHMGR dans lesquelles le volet n'est pas observé à moins que le ligand et le cofacteur ne soient liés. Ainsi, il est très probable qu'en l'absence de ligands, le domaine du volet soit flexible et puisse atteindre plusieurs conformations ouvertes qui peuvent être non résolues dans les structures apo-HMGR.

a Le domaine des volets est désordonné dans les formes liées à l'apo et au NADP+ dans efHMGR. Avec seulement le NADP+ lié dans le site actif, le domaine du lambeau est désordonné et la fraction nicotinamide-ribose dans le NADP+ n'a pas de densité de 2Fo-Fc observable. b En présence de HMG-CoA et de NADP+, le domaine du volet est partiellement fermé (bleu). Dans ce cas, la fraction nicotinamide-ribose du NADP + est également désordonnée, comme le montre la densité de 1, 0 σ 2Fo-Fc. c Le domaine du volet est entièrement fermé (magenta) en présence de mévalonate et d'une molécule NADP+ entièrement ordonnée, comme en témoigne la densité de 2Fo-Fc à 1,0σ. d La superposition du monomère lié au HMG-CoA + NADP+ sur le monomère lié au mévalonate + NADP+ suggère que le domaine de volet partiellement fermé (bleu) est tourné de 15° par rapport à la conformation entièrement fermée (magenta). e Les interactions qui stabilisent le volet complètement fermé (magenta) en présence d'une molécule NADP+ bien ordonnée sont présentées ici. Plusieurs résidus (His-376 et Gln-380) dans le lambeau complètement fermé interagissent avec le fragment nicotinamide-ribose du NADP+ via des interactions médiées par l'eau. On voit que le résidu Asn-184 présent dans le petit domaine se fixe sur le fragment nicotinamide-ribose et participe également aux interactions médiées par l'eau. Le His-376 catalytique est placé plus loin dans le volet partiellement fermé (bleu). Les eaux sont représentées par des sphères rouges et les interactions des liaisons hydrogène sont représentées par des tirets rouges et les distances sont indiquées en Å.

Cependant, avec HMG-CoA et NADP + dans le site actif (Dimer AB), le domaine de volet dans efHMGR est observé dans une conformation "partiellement fermée", similaire à la structure SpHMGR liée à HMG-CoA (PDB : 5wpk)18. Le volet est tourné de 15° par rapport aux volets pmHMGR canoniques (PDB : 4i4b, 1qax)20,32 et cette rotation déplace et réoriente le site actif histidine (His-376) de son site d'action près de Ser-88 et du groupe sulfhydryle CoA. De plus, la molécule NADP + n'est bien ordonnée que de la fraction adénine-ribose jusqu'à la fraction pyrophosphate, tandis que le nicotinamide et la fraction nicotinamide-ribose sont désordonnés, comme en témoignent les facteurs B élevés (~ 65–70 Å2) et l'absence d'une densité 2Fo-Fc observable. En conséquence, aucune interaction n'est observée entre le domaine du lambeau et la fraction nicotinamide-ribose du NADP +, ce qui rend le lambeau relativement flexible pour s'orienter dans une conformation différente exposant le site de liaison du cofacteur (Fig. 3b, d). Nous reconnaissons que la conformation partiellement fermée pourrait également résulter d'un emballage cristallin, comme cela peut être le cas dans la plupart des autres homologues bactériens. Cependant, cette conformation du lambeau fournit la preuve structurelle de sa flexibilité au cours de la réaction.

L'étape d'échange de cofacteur suivant le premier transfert d'hydrure dans laquelle le NADP+ oxydé sort du site actif suivi de la liaison d'un équivalent réduit est cruciale pour la catalyse. Plusieurs structures de divers homologues bactériens suggèrent que le domaine du lambeau alterne entre plusieurs conformations pour faciliter cet échange de cofacteur. Nos données structurelles montrent que le substrat et les sites cofacteurs doivent être occupés pour que le volet se ferme. Cependant, l'étendue de la fermeture du domaine de volet et la position de His-376 par rapport à Ser-88 dépendent de l'interaction entre le nicotinamide-ribose de NADP+ et la première hélice du domaine de volet. Un groupe nicotinamide-ribose 3'-OH ordonné dans le NADP+ facilite les interactions avec plusieurs résidus du lambeau, y compris le catalytique His-376 via un réseau de liaisons hydrogène médiées par l'eau. Cela représente la conformation entièrement fermée comme on l'a vu précédemment dans le complexe abortif pmHMGR et le complexe productif. Cependant, lorsque le groupe nicotinamide-ribose est désordonné, ce qui représente la situation où le cofacteur est prêt à sortir du site actif, l'élimination de ce réseau de liaisons H libère le domaine du volet pour se réorienter dans une conformation partiellement fermée qui laisse le site de liaison du cofacteur ouvert et accessible. Nos données soutiennent l'hypothèse de Miller et al.18 qui ont également visualisé la fermeture partielle du volet en présence de HMG-CoA seul et ont suggéré qu'après le premier transfert d'hydrure, le domaine du volet s'éloigne du site de liaison NADP+, ce qui permet l'échange de cofacteur tout en gardant les intermédiaires liés à l'enzyme.

En collaboration avec le Southern Research Institute (SRI), une bibliothèque de 300 000 composés de la base de données Chembridge 2, SRI et Molecular Libraries Screening Center Network (MLSCN) a été criblée à l'aide d'un test à haut débit (Méthodes). L'activité inhibitrice a été vérifiée dans un criblage dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50. Le test impliquait la réaction d'oxydation du mévalonate en HMG-CoA où la conversion de NADP+ en NADPH a été mesurée par spectrophotométrie à 340 nm. Vingt-six des inhibiteurs ont été sélectionnés pour d'autres tests à Purdue. L'un des composés du panel Chembridge 2, ID 7828315, ci-après dénommé 315 (Fig. 4a) s'est avéré inhiber puissamment efHMGR avec une valeur IC50 de 7, 1 μM (Fig. 4b). Le mécanisme cinétique d'inhibition du composé 315 a ensuite été déterminé dans le sens mévalonate vers HMG-CoA en faisant varier la concentration de mévalonate à des concentrations fixes et variables de 315. Les résultats présentés sur la figure 4c indiquent que le composé 315 est un inhibiteur compétitif contre le mévalonate pour efHMGR avec une valeur Ki résultante de 2, 0 μM. Le composé 315 semble être spécifique vis-à-vis du HMGR de classe II car il ne présente aucune inhibition de l'enzyme humaine de classe I dans cette réaction à une concentration de 100 uM.

a Structure chimique du 315 (Chembridge2 ID 7828315) : acide 5-{[(4-butylphényl)amino]sulfonyl}-2-hydroxybenzoïque. Ce composé est composé d'un groupe hydrophobe 4-butylphényle lié à l'acide 2-hydroxy benzoïque via un groupe amino et un groupe sulfonyle. b Courbes dose-réponse de 315 contre E. faecalis HMG-CoA réductase. La valeur IC50 a été estimée par ajustement de Michaelis-Menten des données de % d'inhibition par rapport à la concentration d'inhibiteur. Les dosages ont été effectués en triple c Un tracé de Lineweaver montre que 315 est un inhibiteur compétitif de efHMGR. Une analyse de ce tracé indique que le 315 inhibe la conversion du mévalonate en HMG-CoA avec un Ki de 2 µM. Les dosages ont été effectués en double et en présence de 0, 5, 7,5 et 10 μM de 315 dans des conditions par ailleurs standard. Les deux ensembles de données ont été analysés par Graphpad Prism 9.0 et présentés sous forme de points de données individuels.

Le composé 315, l'acide 5-{[(4-butylphényl)amino]sulfonyl}-2-hydroxybenzoïque (Fig. 4a), est composé d'un groupe hydrophobe 4-butylphényle lié à l'acide 2-hydroxybenzoïque via un groupe sulfonamide et imite un certain nombre d'interactions du substrat naturel mévalonate/HMG-CoA. Afin d'examiner les détails moléculaires de l'inhibition de efHMGR par 315, un complexe de l'inhibiteur avec efHMGR a été cristallisé (Méthodes). Ces cristaux se sont avérés bien mieux ordonnés que les formes apo ou ligaturées et ont produit une structure à haute résolution qui a été résolue à 1, 27 Å (tableau 1, réf-315). La densité électronique non ambiguë de 315 dans le site actif de efHMGR a démontré les caractéristiques structurelles de 315 qui sont importantes pour la liaison. Le fragment acide 2-hydroxybenzoïque de 315 occupe principalement la poche profonde de liaison au mévalonate de l'enzyme (Fig. 5a), reproduisant certaines des interactions de liaison du substrat de mévalonate. Le groupe amino-sulfonyl butylphényle s'étend ensuite dans la fente largement hydrophobe autrement occupée par le fragment CoA de HMG-CoA. Une superposition de la structure contenant HMG-CoA/mévalonate avec la structure inhibée 315 montre que ce composé occupe un espace similaire au substrat naturel. Ainsi, les données structurelles appuient les données cinétiques selon lesquelles 315 est un inhibiteur compétitif de l'oxydation du mévalonate avec une valeur Ki de 2 μM (Fig. 4c).

une carte de potentiel électrostatique montrant la liaison du 315 dans la poche de liaison du mévalonate présente à l'interface du dimère. Le fragment acide benzoïque est caché à l'intérieur d'une poche tapissée de résidus chargés tandis que le groupe butylphényle de 315 est logé dans un environnement hydrophobe. b Diagramme Ligplot montrant les interactions entre 315 et les résidus de poche de mévalonate dans efHMGR. Les interactions des liaisons hydrogène sont représentées par des lignes pointillées vertes, les eaux sous forme de sphères cyan et les contacts hydrophobes sous forme de demi-cercles bruns. c Les interactions hydrophiles stabilisent 315 dans la poche de liaison au mévalonate de efHMGR. Les grands résidus de domaine, Glu-86, Pro-87, Arg-257, Asn-267 et Gln-359, colorés en vert, interagissent avec le ligand via des interactions de liaison hydrogène directes et médiées par l'eau. Les petits résidus de domaine du monomère adjacent, Asn-187 et Asn-213, colorés en bleu, interagissent également avec le ligand via des molécules d'eau. Les sphères rouges représentent les molécules d'eau. Les tirets rouges représentent les interactions de liaison hydrogène avec les nombres indiquant les distances de liaison hydrogène en Å. d Les interactions hydrophobes stabilisent également 315 dans le site actif. Les résidus hydrophobes tels que Ala-92, Ala-362, Ala-363, Ala-366, Ile-372 et His-376 se tassent contre le groupe butylphényle hydrophobe et stabilisent le ligand. Les résidus sont représentés sous forme de bâtons avec des rayons de Van der Waals sous forme de sphères en pointillés.

Plusieurs interactions de liaison hydrogène directes et médiées par l'eau stabilisent l'inhibiteur dans le site actif (tableau 2). Deux interactions directes de liaison hydrogène sont observées entre le groupe carboxylate de la fraction acide benzoïque de 315 et le groupe guanidinium de Arg-257 (A), situé profondément à l'intérieur de la poche du site actif (Fig. 5b, c). Cette interaction est analogue à celle entre le groupe carboxylique de HMG/mévalonate et Arg-257. L'oxygène sulfonyle du groupe sulfonyl amino de liaison établit une interaction de liaison hydrogène avec le groupe amide de la chaîne latérale Asn-267 (A). Une interaction potentielle de liaison hydrogène faible est également observée entre l'autre sulfonyl oxygène et le groupe amide de la chaîne latérale de Gln-359 (A).

Plusieurs interactions hydrophobes stabilisent également l'inhibiteur dans le site actif. La fraction acide benzoïque de 315 est stabilisée par des interactions hydrophobes avec les résidus Leu-367 (A) et Ile-210 (B). Le fragment butylphényle de 315 est logé dans la fente hydrophobe près de la surface de l'enzyme et stabilisé par des contacts hydrophobes étroits (4,0–5,0 Å) avec les résidus Ala 362, Ala-363 ​​et Ala-366 présents dans la longue hélice α (résidus 350-370) qui précède le domaine du lambeau. L'Ile-372 (A) présent dans la boucle précédant le domaine du lambeau se niche dans la courbure de l'inhibiteur (Fig. 5b, d).

De plus, plusieurs molécules d'eau structurelles tapissent le site actif et forment un réseau de liaisons hydrogène qui relie l'inhibiteur et l'enzyme. Une molécule d'eau assure la médiation d'une interaction de liaison hydrogène entre l'ASN-187 (b) du petit domaine de l'EFHMGR et le groupe 2-hydroxy de la fraction en acide benzoïque de 315 avec le groupe d'amide de chaîne latérale de l'Asn-360 (a) et de la chaîne principale en axyle de la chaîne d'oxyli Zyme (Fig. 5b). Une interaction similaire est également remarquée entre le groupe carboxyle de HMG-CoA et Asn-360 dans d'autres structures de classe II. Le groupe amino de 315 interagit avec les résidus du site actif, Glu-86 et Pro-87 via une troisième molécule d'eau (Fig. 5b, c). Ces interactions médiées par l'eau indiquent les sites potentiels de l'inhibiteur qui pourraient être modifiés lors de l'étape d'optimisation du plomb pour augmenter encore son affinité envers efHMGR (Fig. 5b, c).

Les trois hélices du lambeau sont ordonnées et la première hélice se ferme partiellement sur le site actif en présence de 315. L'absence de NADP+ dans le site actif de la structure liée à 315 exclut les interactions nécessaires, qui sont importantes pour que le lambeau se ferme complètement. Une conformation similaire du lambeau a été observée dans la structure ternaire efHMGR en présence de HMG-CoA et d'un NADP+ partiellement ordonné. Le groupe butylphényle de 315 est bien logé dans la poche hydrophobe formée par les résidus du grand domaine ainsi que le domaine volet du même monomère. Ile-372, His-376 et Leu-379 présentent dans la première hélice de la ligne du rabat la poche hydrophobe d'un côté tandis que plusieurs résidus du grand domaine (du même monomère) dont Ala-92, Ala-362 et Ala-363 ​​constituent l'autre côté (Fig. 5d). La fermeture partielle du lambeau est obtenue par les interactions hydrophobes entre le groupe butylphényle de 315 et le lambeau, et peut interférer avec la liaison du NADPH pendant la catalyse.

Une étude antérieure a rapporté plusieurs inhibiteurs contre SpHMGR qui ont été identifiés par criblage virtuel et également validés par amarrage moléculaire, mutagenèse dirigée et tests enzymatiques. Ces composés ont inhibé le SpHMGR avec une faible IC50 micromolaire et ont ciblé l'espace articulaire entre HMG-CoA et NADPH. Le fragment 3-amino 1,2,5 oxadiazole du composé 4 occupait la poche de liaison du NADPH et interagissait avec l'invariant Asn-212 et le groupe phényle hydrophobe occupait le site de liaison HMG-CoA37. Ainsi, une stratégie d'optimisation de la tête consisterait à étendre 315 au-delà de la poche de liaison HMG-CoA de sorte qu'il occupe également la poche de liaison NADPH, augmentant ainsi la puissance et la spécificité de l'inhibiteur.

Alors que 315 inhibe efHMGR avec une IC50 micromolaire à un seul chiffre (7,1), il échoue complètement à inhiber l'enzyme humaine même à 100 μM. En l'absence d'une structure co-cristalline de l'enzyme humaine avec 315, nous avons superposé la structure humaine (PDB : 1dq9)34 sur Ref-315. Notre analyse structurale suggère que la chaîne latérale imidazole de His-752 dans l'enzyme humaine, qui provient d'une longue boucle d'errance entre Lα5 et Lα6 dans le grand domaine, pose un encombrement stérique à l'oxygène sulfonyle de 315. Dans les homologues bactériens, ce volumineux His-752 est remplacé par Gly-264, qui provient d'une longue hélice alpha (analogue à Lα5) et n'entre pas en conflit avec 3 15. La présence de Leu-851 dans l'homologue humain à la place d'Ala-363 ​​dans efHMGR pose également un conflit stérique avec la fraction acide benzoïque de 315 (Fig. 5a supplémentaire). L'Arg-257 procaryote qui lie le groupe acide benzoïque en 315 est remplacé dans l'enzyme humaine par une lysine dans la boucle cis-peptidique, éliminant l'une des deux liaisons hydrogène. La configuration de l'anneau nicotinamide pour le transfert d'hydrure change également, nécessitant d'autres modifications des contours de la poche du site actif. Ces différences, parmi d'autres, ont peut-être entraîné la différence prononcée de puissance d'inhibiteur et de sélectivité de 315 vis-à-vis de l'enzyme bactérienne.

Des recherches antérieures ont montré que les statines sont de faibles inhibiteurs des réductases HMG-CoA de classe II, telles que efHMGR, par rapport à l'inhibition nanomolaire des homologues de classe I. L'analyse cinétique montre que 315 ciblant les homologues de classe II, en particulier efHMGR, est très puissant par rapport aux statines. À une concentration de 50 μM, 315 atteint 80 % d'inhibition de l'efHMGR, contrairement à la lovastatine qui atteint 32 % d'inhibition. Pour comprendre la différence au niveau moléculaire, la structure pmHMGR liée à la lovastatine (PDB : 1to2)38 a été superposée à la structure efHMGR et l'interaction entre la lovastatine et l'efHMGR a été analysée. Étant donné que les résidus du site actif sont conservés entre les deux homologues de classe II, l'hypothèse est que la lovastatine devrait interagir avec efHMGR d'une manière similaire. Ainsi, au lieu de deux interactions de liaison hydrogène entre Arg-257 et le fragment acide benzoïque dans 315, une seule liaison H est observée entre l'Arg-257 et le groupe carboxylate dans la lovastatine. Par rapport à quatre interactions directes et quatre à médiation par l'eau entre 315 et efHMGR, la lovastatine effectue trois interactions directes et deux à médiation par l'eau avec efHMGR (Fig. 5b supplémentaire). Le groupe butylphényle de 315 est bien logé dans une vaste poche hydrophobe formée par plusieurs résidus du domaine de lambeau ainsi que par un grand domaine de l'enzyme. Cependant, l'anneau décaline de la lovastatine empêche la fermeture du domaine du lambeau et l'interaction hydrophobe étendue n'est pas observée.

Cibler les bactéries pathogènes sans perturber le biome normal du système est un élément positif pour les antibactériens à utiliser dans les approches thérapeutiques. Les bactéries intestinales courantes n'utilisent pas la voie du mévalonate, de sorte que les inhibiteurs ciblés sur le HMGR d'espèces bactériennes pathogènes à Gram positif telles que le SARM (Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline) et l'ERV (entérocoque résistant à la vancomycine) laisseraient d'autres bactéries bénéfiques intactes. Les applications topiques de ces inhibiteurs peuvent également s'avérer utiles dans des infections pathogènes similaires. Notre examen initial de 315 indique que les composés basés sur cet échafaudage pourraient bien être hautement sélectifs vis-à-vis des HMGR bactériens. Les différences architecturales dans les sites actifs des enzymes humaines et bactériennes peuvent être davantage exploitées pour optimiser la puissance et la sélectivité des inhibiteurs sur la base des interactions que nous avons observées entre 315 et les deux classes de HMG-CoA réductase. De plus, tous les résidus de sites actifs interagissant avec 315 sont hautement conservés dans les homologues bactériens gram-positifs (Fig. 6 supplémentaire), ce qui ouvre la perspective de cibler spécifiquement les pathogènes gram-positifs avec un inhibiteur commun, augmentant ainsi leur portée thérapeutique.

La partie HMG-CoA réductase du gène mvaE d'E. faecalis a été clonée (résidus 381-803) dans le vecteur pET28a et exprimée avec une étiquette 6X-Histidine N-terminale dans des cellules Escherichia coli BL21 (DE3)17. Les cellules ont été cultivées dans le milieu Luria Broth en présence de kanamycine (20 µg.ml-1) à 0, 6–0, 7 O.D600 à 37 ° C et induites avec 0, 5 mM d'IPTG pendant 4 h. Les cellules ont été culottées à 4000 g pendant 20 min et remises en suspension dans du tampon de lyse A (imidazole 10 mM, HEPES 20 mM pH 8, 0, NaCl 300 mM) puis lysées par une cellule de pression française à 18 000 psi. L'extrait cellulaire résultant a été centrifugé dans une ultracentrifugeuse à 40 000 tr/min pendant 1 h. Le surnageant (cytosol) a été chargé sur une colonne de 2 ml de résine nickel-NTA. La colonne a été lavée avec le tampon A et le tampon B (50 mM imidazole, 20 mM HEPES pH 8,0, 300 mM NaCl) et éluée avec le tampon C (100 mM imidazole, 20 mM HEPES pH 8,0, 300 mM NaCl) et le tampon D (500 mM imidazole, 20 mM HEPES pH 8,0, 300 mM NaCl) respectivement. Les fractions contenant efHMGR, identifiées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (10% SDS PAGE), ont démontré une seule bande protéique à ~ 50 KDa. Les fractions contenant efHMGR ont été regroupées et précipitées en ajoutant un volume 3X de sulfate d'ammonium saturé (pH 7, 0) sous agitation constante à 4 ° C pendant 1 h, puis sédimentées par centrifugation à 14 000 tr / min pendant 20 min. Le culot a été remis en suspension dans HEPES 5 mM pH 8,0 et NaCl 300 mM. La concentration en protéines a été mesurée avec le test de Bradford. La construction exprime 35 mg de protéine HMGR marquée 6X-His N-terminale par litre de culture bactérienne. Avant la cristallisation, la protéine a été dialysée contre HEPES 5 mM pH 8,0, NaCl 300 mM afin d'échanger le sulfate d'ammonium.

Les conditions de cristallisation initiales de l'apoenzyme efHMGR (Ref-apo) ont été sélectionnées avec l'aide d'une installation de cristallisation robotisée au Hauptman-Woodward Medical Research Institute, Buffalo, New York. Le coup initial a été encore optimisé, produisant des cristaux hexagonaux de P61 d'apoenzyme efHMGR qui ont été cultivés par la méthode de diffusion de vapeur en goutte assise à 20 ° C à partir de solutions contenant 3 µl de protéine à 10 mg.ml-1 et 3 µl de 0,1 M MES pH 6,5, acétate de calcium 50 mM, 16% PEG8000. Les cristaux d'apoenzyme ont atteint une taille de 0,4 × 0,2 × 0,1 mm à 20 ° C en 15 à 20 jours. Pour la collecte de données à 100 K, les cristaux ont été cryoprotégés avec une introduction par étapes de 20 % de PEG400 dans un tampon de cristallisation et congelés instantanément dans de l'azote liquide.

Pour le complexe ternaire (Ref-ternaire), efHMGR a été co-cristallisé avec NADP + et HMG-CoA en utilisant la technique de diffusion de vapeur en goutte assise à 20 ° C. Des cristaux de C2 en forme de plaque sont apparus en présence de NADP+ 1,5 mM, de HMG-CoA 150 µM, de MES 0,1 M pH 6,7, d'acétate de calcium 50 mM et de PEG 8000 à 8 %. 10 mg.ml-1 de protéine ont été utilisés dans ces essais. Les cristaux sont apparus en 1 à 2 jours et ont atteint une taille finale de 0,2 × 0,1 × 0,05 mm3. Les cristaux ont été cryoprotégés avec 35 % de glycérol dans le tampon de cristallisation et congelés instantanément dans de l'azote liquide.

La solution mère de l'inhibiteur 315 a été préparée par dissolution dans du DMSO à 100 %. Le complexe de la protéine efHMGR avec l'inhibiteur 315 (Ref-315) a été co-cristallisé dans 25 % de PEG 4000, 0,17 M d'acétate de sodium, 0,085 M de Tris-HCl à pH 8,5 et 2 % de glycérol. La protéine était à 14 mg.ml-1 dans HEPES 5 mM pH 8, 0, chlorure de potassium 300 mM, inhibiteur 315 650 μM, DMSO 1, 6% et des traces de sulfate d'ammonium et d'imidazole. Des cristaux de P212121 en forme de tige sont apparus en quelques jours et ont atteint une taille finale de 0,04 × 0,04 × 0,275 mm3. Les cristaux ont été cryoprotégés dans du PEG 400 à 15 % dans le tampon de cristallisation et congelés instantanément dans de l'azote liquide.

Les données de diffraction natives à 2, 25 Å pour les cristaux Ref-apo ont été collectées sur la ligne de lumière SERCAT-ID à Advanced Photon Source (APS, Argonne National Laboratory, Argonne, IL) à l'aide d'un détecteur CCD. Les cristaux ref-apo se sont développés dans le groupe d'espace P61 avec quatre monomères dans l'unité asymétrique et les dimensions cellulaires de a, b = 168,7 Å, c = 120,2 Å, α, β = 90°, γ = 120°.

Les données de diffraction monocristalline pour les cristaux Ref-ternaires ont été collectées sur la ligne de lumière SERCAT-BM à l'APS avec un détecteur CCD Rayonix (MAR 300). Les données ont été indexées, intégrées et mises à l'échelle à 2,27 Å. Le réseau cristallin appartient au groupe d'espace monoclinique C2 avec a = 241,3 Å, b = 62,6 Å, c = 171,9 Å, α = 90°, β = 133,5°, γ = 90° et quatre monomères par unité asymétrique.

La structure cristalline de l'efHMGR complexé avec l'inhibiteur 315 a été collectée à l'APS sur la ligne de lumière GM/CA à l'aide d'un détecteur CCD. Les données ont été indexées, intégrées et mises à l'échelle à 1,27 Å. Le réseau cristallin appartient au groupe d'espace orthorhombique P212121 avec a = 72,5 Å, b = 81,1 Å, c = 152,9 Å, α, β, γ = 90◦ et deux monomères par unité asymétrique. Le traitement et la réduction des données pour les ensembles de données Ref-apo, Ref-ternaire et Ref-315 ont tous été effectués à l'aide de HKL200039 et les statistiques sont résumées dans le tableau 1.

Les informations de phase initiale pour la structure de l'apoenzyme efHMGR ont été obtenues par remplacement moléculaire en utilisant le dimère pmHMGR (PDB : 1qax, 38 % d'identité de séquence avec efHMGR) comme modèle de recherche initial pour les deux dimères dans l'unité asymétrique avec Phaser40 dans la suite CCP441. Les résidus 13 à 370 ont été modélisés dans la carte de densité électronique et un raffinement de corps rigide a été effectué. Ce modèle a ensuite été soumis à Resolve42, qui implique une méthode de modification de densité d'amorçage et de commutation pour améliorer la carte de densité d'électrons. Ce modèle initial a d'abord été soumis à un raffinement de recuit simulé dans la suite CNS43. Ce modèle a ensuite été corrigé, étendu et affiné par rapport à l'ensemble de données de 2, 25 Å par un cycle itératif d'affinement individuel du facteur B, de minimisation du gradient dans REFMAC44 suivi d'une correction du modèle et d'un placement de solvant dans Coot45. Des occupations partielles, des conformations multiples, des ions calcium, des molécules d'acide 2-(N-morpholino) éthane sulfonique (MES) et des molécules d'eau supplémentaires ont été ajoutés au modèle. Dans les étapes ultérieures, le modèle a été soumis à un cycle de raffinement final dans Phenix refresh46. Le modèle final se compose de 4 monomères avec les résidus 11-370 dans la chaîne A, 13-372 dans la chaîne B, 11-370 dans la chaîne C et 13-369 dans la chaîne D, 5 molécules MES, 2 sulfates, 4 éthylène glycol, 6 diéthylène glycol, 10 ions calcium et 646 molécules d'eau avec Rwork et Rfree de 17,5 et 20,9 respectivement. Après le raffinement, le modèle a été évalué pour les erreurs à l'aide de Procheck47 et Molprobity48.

La structure efHMGR liée au ligand (Ref-ternaire) a été résolue en utilisant l'apo-efHMGR natif comme modèle de recherche. Un raffinement de corps rigide a été effectué sur le modèle résultant suivi de Resolve42 pour réduire le biais du modèle. La densité de différence Fo-Fc calculée à ce stade a montré une densité supplémentaire dans le site actif de tous les monomères. Cela nous a permis de modéliser le substrat HMG-CoA, le produit mévalonate et le cofacteur NADP+. De plus, de grandes régions de densité supplémentaire à l'extrémité C-terminale de la protéine au-delà du résidu 370 (le dernier résidu visible dans l'apoenzyme) dans deux des quatre monomères ont été observées et utilisées pour construire le volet flexible comprenant 51 acides aminés pour le monomère C (370– n421) et 34 résidus pour le monomère B (370 - 421). Ce modèle initial a d'abord été soumis à quelques cycles de raffinement du facteur B individuel suivis d'un raffinement de recuit simulé dans le SNC. Le modèle a ensuite été corrigé et élargi par la construction de modèles interactifs et le placement de solvants dans Coot, suivis de quelques cycles supplémentaires de raffinement restreint dans REFMAC et Phenix raffinage. Le modèle final se compose de 4 monomères avec les résidus 13-370 dans la chaîne A, -4-421 dans la chaîne B, 0-421 dans la chaîne C et 13-369 dans la chaîne D modélisés dans la carte de densité électronique, 1 HMG-CoA, 1 mévalonate et 4 molécules NADP+, 7 ions calcium, 9 acétate, 7 glycérol et 340 molécules d'eau avec un Rwork et Rfree de 19,6 et 23,9 respectivement.

La structure efHMGR complexée avec l'inhibiteur 315 a été résolue en utilisant le monomère efHMGR sans ligand comme modèle de recherche. La structure a été initialement affinée avec Phenix en utilisant des méthodologies de recuit simulé et plus tard de gradient conjugué. La densité Fo-Fc non ambiguë dans le site actif a révélé la présence de l'inhibiteur dans le site actif. Le modèle de l'inhibiteur a été construit dans Chemdraw et l'énergie minimisée dans le module eLBOW49 puis placée à l'aide du module LigFit de Phenix. Entre les raffinements, la structure du modèle a été ajustée à l'aide de COOT comme indiqué par les densités de différence Fo-Fc. Le modèle final se compose de deux monomères avec les résidus 13-421 dans la chaîne A, 13-422 dans la chaîne B, 1 ion calcium, 2 molécules d'inhibiteur (315), 3 molécules de sulfate et 973 molécules d'eau. Le post-raffinement de tous les modèles a été évalué pour les erreurs à l'aide de Procheck47 et Molprobity48. Tous les modèles montrent une bonne géométrie sans résidus dans la région aberrante du graphique de Ramachandran. La collecte de données et les statistiques de raffinement sont résumées dans le tableau 1. Les interactions protéine-ligand sont analysées à l'aide de Ligplot50. Les chiffres ont été générés à l'aide de Pymol51. Les séquences ont été alignées par le programme d'alignement de séquences multiples Tcoffee et visualisées à l'aide d'Espript52.

Dosage/Plaquage du composé : Vingt-cinq nanolitres (nL) de composés dans du DMSO ont été distribués dans des plaques traitées en surface transparentes non contraignantes à 384 puits, ce qui a donné des concentrations finales de 10 µM de composé dans le test.

Quinze µL de mélange de réactifs HMG-CoA réductase qui comprenait la coenzyme A, le NADP+ et le mévalonate dans le tampon de dosage ont été ajoutés à chaque puits des plaques à 384 puits précédemment dosées en composé. La réaction a été initiée avec l'ajout de 10 µL de HMG-CoA réductase diluée dans un tampon de dosage. Les concentrations finales dans la réaction étaient de 2 mM de coenzyme A, 4 mM de NADP+, 4 mM de mévalonate et 15 µg.ml-1 HMG-CoA réductase diluée dans un tampon de dosage (100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM chlorure de potassium, 2 % DMSO et 0,01 % Tween 20). La plaque de test a été immédiatement transférée dans un lecteur de microplaques Perkin Elmer Envision et l'absorbance du NADPH a été mesurée à 340 nm toutes les 16 s pendant 160 s. Chaque plaque comportait 64 puits témoins dans les quatre colonnes extérieures, 32 contenant le mélange réactionnel complet avec le témoin de support (réaction complète) et 32 ​​dans lesquels le mévalonate avait été omis53.

L'inhibition de l'acylation oxydative du mévalonate en HMG-CoA, par une statine commune, la lovastatine, et le 315, a été étudiée sur des HMG-CoA réductases de deux espèces différentes en utilisant des conditions de réaction approximativement similaires. En bref, les réactions (100 μL) ont été mises en place dans une plaque à 96 puits, à fond plat transparent et à demi-zone (Corning Costar, Kennebunk, ME). Tout d'abord, 2,5 μL du composé à une concentration en gradient ont été ajoutés dans les puits, suivis du mélange maître. La composition du mélange maître est légèrement différente entre les deux classes de réductases. Pour efHMGR, la composition du mélange maître est ; KCl 100 mM, Tris HCl 100 mM, Coenzyme A 1,5 mM, Mévalonate 4,5 mM, NADP+ 3 mM et de l'eau pour ajuster les concentrations. Pour la HMG-CoA réductase humaine, la composition du mélange maître est ; NaCl 50 mM, Tris HCl 100 mM, EDTA 1 mM, DTT 5 mM, Coenzyme A 5 mM, Mévalonate 6 mM, NADP+ 5 mM et de l'eau pour ajuster les concentrations. La plaque avec l'inhibiteur et le mélange maître ajoutés a été incubée à 37 °C pendant 3 min jusqu'à ce que la ligne de base soit stable. La réaction a été initiée en ajoutant l'enzyme avec des volumes appropriés pour amener le volume final jusqu'à 100 μL. La réduction de NADP+ a été surveillée à 37 °C en continu en mesurant l'absorbance à 340 nm. L'absorbance a été lue toutes les 20 secondes à l'aide d'un lecteur de plaques CLARIOstar Plus (BMG Labtech, Cary, NC). Les premières lectures des courbes de progression ont été utilisées pour calculer les pentes initiales (IS). Les valeurs IC50 ont été estimées par ajustement de Michaelis-Menten des données de concentration d'inhibiteur en % par rapport à l'inhibition en utilisant une régression non linéaire dans GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Chaque expérience a été réalisée en triple dans des conditions de dosage identiques. Des dosages en l'absence d'enzyme ont été utilisés comme contrôles expérimentaux pour déterminer les pentes de base. Le % d'inhibition a été calculé selon l'équation suivante.

Le test d'oxydation du mévalonate a été effectué dans un volume de réaction de 200 μl à 37 ° C et la réaction a été contrôlée par l'apparition de NADPH à 340 nm. Les conditions de test standard comprenaient NADP+ 4 mM, coenzyme A 1 mM, mévalonate aux concentrations suivantes : 0,2 mM, 0,33 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,67 mM, 1 mM, 2 mM. La concentration d'inhibiteur (315) variait également entre 5 μM, 7,5 μM et 10 μM. Le tampon de dosage comprenait 100 mM de KCl et 100 mM de Tris-Cl pH 8,0. Le mévalonate, le NADP+ et l'inhibiteur 315 ont été incubés dans le tampon d'essai à 37°C et la réaction a été initiée par addition de l'enzyme. La valeur Ki a été déterminée avec la concentration de mévalonate variée comme décrit ci-dessus, en gardant les autres conditions de test standard. Le double tracé réciproque de cette étude d'inhibition a été obtenu où 1/taux initial a été tracé en fonction de 1/concentration de substrat et les données ont été ajustées par régression linéaire dans Graphpad Prism 9.0. Le KM (apparent) et le Km ont été obtenus à partir de ce graphique. La valeur Ki a été calculée sur la base de l'équation :

Le numéro d'accession des séquences utilisées de la base de données Uniprot :

Q8DNS5 : Streptococcus pneumoniae HMG-CoA réductase

Q9FD86 : Staphylococcus aureus HMG-CoA réductase

Q9FD60 : Streptococcus pyogenes HMG-CoA réductase

A0A7ZD9J92 : Enterococcus hirae HMG-CoA réductase

Q9FD65 : Enterococcus faecium HMG-CoA réductase

Q8Y8R9 : Listeria monocytogenes HMG-CoA réductase

P13702 : HMG-CoA réductase de Pseudomonas mevalonii

A9BQX8 : Delftia acidovorans HMG-CoA Réductase

B4EKH5 : Burkholderia cenocepacia HMG-CoA Réductase

Q9FD70 : Enterococcus faecalis HMG-CoA réductase

Les données cinétiques ont été analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism Version 9.0. Les données sont présentées sous forme de points de données individuels. La reproductibilité a été confirmée en effectuant trois points de données indépendants pour la figure 4b et deux points de données indépendants pour la figure 4c, comme décrit dans la légende de la figure.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données de réflexion et les coordonnées finales des structures cristallographiques discutées ont été soumises à la RCSB Protein Data Bank (http://pdb.org) sous les codes d'accès suivants : E. faecalis HMG-CoA réductase apo (7M66), HMG-CoA, mévalonate et NADP+ lié (7M1Z) et composé 315 lié (7M3H), comme décrit dans le tableau 1. Toutes les données sources derrière les graphiques cinétiques présentés dans les figures sont présentées dans les données supplémentaires 1 et les données supplémentaires 2.

Hollenbeck, BL & Rice, LB Mécanismes de résistance intrinsèque et acquise chez les entérocoques. Virulence 3, 421–569 (2012).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Paulsen, IT et al. Rôle de l'ADN mobile dans l'évolution d'Enterococcus faecalis résistant à la vancomycine. Sciences 299, 2071-2074 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Simor, AE et al. Staphylococcus aureus et les entérocoques résistants à la vancomycine et de l'infection à Clostridium difficile dans les hôpitaux canadiens. Infecter. Hosp. Épidémiol. 34, 687–693 (2013).

Article Google Scholar

Goldstein, JL & Brown, MS Régulation de la voie du mévalonate. Nature 343, 425–430 (1990).

Article CAS PubMed Google Scholar

Johnson, EA & Schroeder, WA Caroténoïdes microbiens. Adv. Biochimie. Ing. Biotechnol. 53, 119–178 (1996).

CAS PubMed Google Scholar

Reusch, VM & Salton, MRJ Lipopolymères, isoprénoïdes et assemblage de la paroi cellulaire gram-positive. Crit. Rév. Microbiol. 11, 129-155 (1984).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pelz, A. et al. Structure et biosynthèse de la staphyloxanthine de Staphylococcus aureus. J. Biol. Chim. 280, 32493–32498 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wilding, EI et al. Essentialité, expression et caractérisation de la classe II 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme a réductase de Staphylococcus aureus. J. Bactériol. 182, 5147-5152 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wilding, EI et al. Identification, évolution et caractère essentiel de la voie du mévalonate pour la biosynthèse de l'isopentényl diphosphate chez les coques à Gram positif. J. Bactériol. 182, 4319–4327 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lichtenthaler, HK Biosynthèse des isoprénoïdes non mévalonates : enzymes, gènes et inhibiteurs. Biochimie. Soc. Trans. 28, 785–789 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wagner, WP, Helmig, D. & Fall, R. Biosynthèse de l'isoprène dans Bacillus subtilis via la voie du phosphate de méthylérythritol. J. Nat. Prod. 63, 37-40 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ducarmon, QR et al. Microbiote intestinal et résistance à la colonisation contre les infections bactériennes entériques. Microbiol. Mol. Biol. Rév.83, 716299 (2019).

Bochar, DA, Freisen, J., Stauffacher, CV et Rodwell, VW Chimie complète des produits naturels (Elsevier, 1999).

Hedl, M., Tabernero, L., Stauffacher, CV & Rodwell, VW Class II 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme areductases? J. Bactériol. 186, 1927-1932 (2004).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Istvan, ES HMG-CoA réductases bactériennes et mammifères : enzymes apparentées avec des architectures distinctes. Courant. Avis. Structure. Biol. 11, 746–751 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hedl, M. et al. Enterococcus faecalis acétoacétyl-coenzyme A thiolase/3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A réductase, une protéine à double fonction de la biosynthèse de l'isopentényl diphosphate. J. Bactériol. 184, 2116-2122 (2002).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hedl, M. Biosynthèse du pyrophosphate d'isopentényle chez les bactéries : gènes et enzymes de la voie du mévalonate (Université Purdue, 2003).

Miller, BR & Kung, Y. Caractéristiques structurelles et mouvements de domaine contrôlant la liaison au substrat et la spécificité du cofacteur dans la HMG-CoA réductase de classe II. Biochimie 57, 654–662 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Peacock, RB et al. Caractérisation structurale et fonctionnelle de l'oligomérisation dynamique dans la HMG-CoA réductase de burkholderia cenocepacia. Biochimie 58, 3960–3970 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Steussy, CN et al. Un nouveau rôle pour la coenzyme a lors du transfert d'hydrure dans la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme a réductase. Biochimie 52, 5195–5205 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lawrence, CM, Rodwell, VW & Stauffacher, CV Structure cristalline de Pseudomonas mevalonii HMG-CoA réductase à une résolution de 3,0 angström. Sciences 268, 1758-1762 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Liu, Y. & Eisenberg, D. Échange de domaine 3D : alors que les domaines continuent d'échanger. Protéine Sci. 11, 1285-1299 (2002).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rousseau, F., Schymkowitz, JWH & Itzhaki, LS L'histoire qui se déroule de l'échange de domaine en trois dimensions. Structure 11, 243-251 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Istvan, EvaS., Palnitkar, Maya, Buchanan, Susan, K. & Deisenhofer, J. Structure cristalline de la partie catalytique de la HMG-CoA réductase humaine : aperçu de la régulation de l'activité et de la catalyse. EMBO J. 19, 819–830 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vögeli, B., Shima, S., Erb, TJ & Wagner, T. Structure cristalline de l'archée HMG-CoA réductase: aperçu des changements structurels de l'hélice C-terminale de l'enzyme de classe I. FEBS Lett. 593, 543-553 (2019).

Article PubMed Google Scholar

Ragwan, ER, Arai, E. & Kung, Y. Nouveaux instantanés cristallographiques de mouvements de grands domaines dans la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase bactérienne. Biochimie 57, 5715–5725 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Huang, Y., Gao, M. et Su, Z. Exploration des rôles de la proline dans l'échange de domaine tridimensionnel à partir de l'analyse de la structure et des simulations de dynamique moléculaire. Protéine J. 37, 13–20 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gil, G., Faust, JR, Chin, DJ, Goldstein, JL & Brown, MS Le domaine lié à la membrane de la HMG CoA réductase est nécessaire pour la dégradation de l'enzyme renforcée par le stérol. Cellule 41, 249-258 (1985).

Article CAS PubMed Google Scholar

Haines, BE, Steussy, CN, Stauffacher, CV & Wiest, O. Modélisation moléculaire de la voie de réaction et des réactions de transfert d'hydrure de la HMG-CoA réductase. Biochimie 51, 7983–7995 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Baker, PJ, Britton, KL, Rice, DW, Rob, A. & Stillman, TJ Conséquences structurelles des modèles de séquence dans la région des empreintes digitales du pli de liaison des nucléotides. Implications pour la spécificité des nucléotides. J. Mol. Biol. 228, 662–671 (1992).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kim, D.-Y., Stauffacher, CV & Rodwell, VW Double spécificité de coenzyme de Archaeoglobus fulgidus HMG-CoA réductase. Protéine Sci. 9, 1226-1234 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tabernero, L., Bochar, DA, Rodwell, VW & Stauffacher, CV La fermeture induite par le substrat du domaine du lambeau dans les structures complexes ternaires donne un aperçu du mécanisme de catalyse par la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA réductase. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 96, 7167–7171 (1999).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Friesen, JA, Lawrence, M., C., Stauffacher, CV & Rodwell, VW Déterminants structurels de la spécificité des coenzymes nucléotidiques dans le pli de liaison dinucléotidique distinctif de la HMG-CoA réductase de Pseudomonas mevalonii. Biochimie 35, 11945–11950 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Istvan, ES & Deisenhofer, J. La structure de la partie catalytique de la HMG-CoA réductase humaine. Biochim. Biophys. Acta1529, 9–18 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Qureshi, N., Dugan, RE, Cleland, WW, John, W. & Porter Analyse cinétique des étapes réductrices individuelles catalysées par la β-hydroxy-β-méthylglutaryl-coenzyme A réductase obtenue à partir de levure. Biochimie 15, 4191–4197 (1976).

Article CAS PubMed Google Scholar

Veloso, D., Cleland, WW & Porter, JW Propriétés du pH et mécanisme d'action chimique de la 3-hydroxy-3-méthylglutary 1 coenzyme A réductase. Biochimie 20, 887–894 (1981).

Article CAS PubMed Google Scholar

Li, D. et al. Conception basée sur la structure et criblage de nouveaux inhibiteurs de la classe II 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme a réductase de Streptococcus pneumoniae. J. Chem. Inf. Modèle. 52, 1833–1841 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tabernero, L., Rodwell, VW & Stauffacher, CV Structure cristalline d'une statine liée à une hydroxyméthylglutaryl-CoA réductase de classe II. J. Biol. Chim. 278, 19933–19938 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Otwinowski, Z. & Minor, W. Traitement des données de diffraction des rayons X collectées en mode oscillation. Méthodes Enzymol. 276, 307–326 (1997).

Article CAS PubMed Google Scholar

McCoy, AJ et al. Logiciel de cristallographie Phaser. J. Appl. Cristallologue. 40, 658–674 (2007).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

PCC4. Projet de calcul collaboratif numéro 4. La suite de programmes CCP4 pour la cristallographie des protéines. Acta Crystallogr. Secte. D. Biol. Cristallologue. 50, 760–763 (1994).

Article Google Scholar

Terwilliger, T. SOLVE et RESOLVE : solution de structure automatisée, modification de la densité et construction de modèles. J. Radiat synchrotron. 11, 49-52 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pannu, N.-É. et al. Crystallography & {NMR} system : une nouvelle suite logicielle pour la détermination de la structure macromoléculaire. Acta Crystallogr. D. Biol. Cristallologue. 54, 905–921 (1998).

Article PubMed Google Scholar

Murshudov, GN, Vagin, AA & Dodson, EJ Raffinement des structures macromoléculaires par la méthode du maximum de vraisemblance. Acta Crystallogr. Secte. D : Biol. Cristallologue. 53, 240-255 (1997).

Article CAS Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot : outils de création de modèles pour les graphiques moléculaires. Acta Crystallogr. Secte. D. Biol. Cristallologue. 60, 2126-2132 (2004).

Article Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX : Un système complet basé sur Python pour la solution de structure macromoléculaire. Acta Crystallogr. Secte. D. Biol. Cristallologue. 66, 213-221 (2010).

Article CAS Google Scholar

Laskowski, RA, MacArthur, MW & Thornton, JM PROCHECK : validation des coordonnées de la structure des protéines. Int. Tableaux Crystallogr.https://doi.org/10.1107/97809553602060000882 (2012).

Chen, VB et al. MolProbity : validation de la structure de tous les atomes pour la cristallographie macromoléculaire. Acta Crystallogr. Secte. D. Biol. Cristallologue. 66, 12–21 (2010).

Article CAS Google Scholar

Moriarty, NW, Grosse-Kunstleve, RW & Adams, PD Constructeur de ligands électroniques et atelier d'optimisation (eLBOW) : un outil pour la génération de coordonnées et de contraintes de ligands. Acta Crystallogr. Secte. D. Biol. Cristallologue. 65, 1074-1080 (2009).

Article CAS Google Scholar

Laskowski, RA & Swindells, MB LigPlot+ : plusieurs diagrammes d'interaction ligand-protéine pour la découverte de médicaments. J. Chem. Inf. Modèle. 51, 2778–2786 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

DeLano, WL Pymol : Un outil graphique moléculaire open-source. CCP4 Newsl. Protéine Crystallogr 40, 82–92 (2002).

Google Scholar

Gouet, P., Courcelle, E., Stuart, DI & Métoz, F. ESPript : Analyse d'alignements de séquences multiples dans PostScript. Bioinformatique 15, 305–308 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Stauffacher, CV Écran à haut débit pour identifier les composés qui inhibent les HMG-CoA réductases de classe II - Écran primaire. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/bioassay/1066 (2008).

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Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health R01 GM111645 et R03 MH082373 à CVS. La recherche a utilisé les ressources de l'Advanced Photon Source, une installation utilisateur du Bureau des sciences du Département américain de l'énergie (DOE), exploitée pour le Bureau des sciences du DOE par le Laboratoire national d'Argonne sous le contrat n° DE-Ac02-0CH11357. Les données ont été recueillies sur la ligne de lumière APS GM/CA ; GM/CA@APS a été financé par l'Institut national du cancer (ACD-12002) et l'Institut national des sciences médicales générales (AGM-1200, P30GM138396). Les auteurs remercient le soutien de l'installation de diffraction macromoléculaire des rayons X du Purdue Center for Cancer Research, P30 CA023168. Nous tenons à remercier l'installation de criblage de cristaux Hauptman Woodward pour le criblage initial à haut débit des conditions de cristallisation et le Dr Lucille White du Southern Research Institute, Alabama pour avoir effectué les tests de criblage à haut débit de composés avec efHMGR. Cette publication a été rédigée par DLP à titre personnel et ne représente pas les opinions de la Food and Drug Administration, du ministère de la Santé et des Services sociaux, ni du gouvernement fédéral.

Sucharita Bose

Adresse actuelle : Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine, GKVK Post Bellary Road, Bangalore, 560065, Inde

Daneli Lopez-Perez

Adresse actuelle : Food and Drug Administration, 10903 New Hampshire Avenue, Silver Spring, MD, 20993, États-Unis

Mohamed N. Seleem

Adresse actuelle : Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, VA-MD College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, 205 Duck Pond Drive, Blacksburg, VA, 24061, États-Unis

Département des sciences biologiques, Université Purdue, 915 West State Street, West Lafayette, IN, 47907, États-Unis

Sucharita Bose, C. Nicklaus Steussy, Tim Schmidt, Samadhi C. Kulathunga, Andrew D. Mesecar et Cynthia V. Stauffacher

Département de chimie, Université Purdue, 560 Oval Drive, West Lafayette, IN, 47907, États-Unis

Daneli Lopez-Perez et Mark Lipton

Département de pathobiologie comparée, Collège de médecine vétérinaire, Université Purdue, 625 Harrison Street, West Lafayette, IN, 47907, États-Unis

Mohamed N. Seleem

Département de biochimie, Université Purdue, 175 South University Street, West Lafayette, IN, 47907, États-Unis

Andrew D. Mesecar et Victor W. Rodwell

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SB a purifié la protéine efHMGR, cristallisé et affiné les structures apo et ligaturées. DLP a synthétisé, purifié et caractérisé 315. Initialement, SB a co-cristallisé 315 avec efHMGR qui a diffracté à 1,7 Å. Plus tard, CNS et TS ont de nouveau co-cristallisé 315 avec la protéine, résolu et affiné la structure à une résolution plus élevée (1,27 Å). Le CNS a effectué les derniers tours de raffinement de l'apo et des structures ligaturées. SB et CNS ont réalisé les expériences cinétiques de efHMGR avec l'inhibiteur 315 et SCK ont réalisé les expériences IC50 de 315 et d'inhibiteur de lovastatine contre efHMGR et HMGR humain. MNS et ML ont évalué le potentiel de l'inhibiteur pour un développement ultérieur et VWR a développé le protocole de purification pour efHMGR et réalisé les expériences cinétiques initiales avec des composés sélectionnés. ADM, MLCNS et CVS ont coordonné le projet. SB, CNS et CVS ont analysé les structures et rédigé l'article avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Cynthia V. Stauffacher.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Yan Kung et Jeff Watson pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la gestion principale : Gene Chong.

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Réimpressions et autorisations

Bose, S., Steussy, CN, López-Pérez, D. et al. Cibler Enterococcus faecalis HMG-CoA réductase avec un inhibiteur non statine. Commun Biol 6, 360 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04639-y

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Reçu : 28 septembre 2021

Accepté : 28 février 2023

Publié: 03 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04639-y

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