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Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 16031 (2022) Citer cet article

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La cristallisation des protéines dans les cellules (ICPC) a été étudiée comme une technique pour soutenir l'avancement de la biologie structurale car elle ne nécessite pas de purification des protéines et un processus de cristallisation compliqué. Cependant, seules quelques structures protéiques ont été rapportées car ces cristaux se sont formés accidentellement dans des cellules vivantes et sont de taille et de qualité insuffisantes pour l'analyse de la structure. Ici, nous avons développé une méthode de cristallisation des protéines acellulaires (CFPC), qui implique la cristallisation directe des protéines à l'aide de la synthèse protéique acellulaire. Nous avons réussi la cristallisation et la détermination de la structure de cristaux de polyèdres nanométriques (PhC) à une haute résolution de 1,80 Å. De plus, des nanocristaux ont été synthétisés à une échelle de réaction de seulement 20 μL en utilisant la méthode de dialyse, permettant une analyse structurale à une résolution de 1,95 Å. Pour démontrer davantage le potentiel du CFPC, nous avons tenté de déterminer la structure de la protéine d'inclusion cristalline A (CipA), dont la structure n'avait pas encore été déterminée. Nous avons ajouté des réactifs chimiques comme inhibiteur de jumelage à la solution CFPC, ce qui nous a permis de déterminer la structure de CipA à une résolution de 2,11 Å. Cette technologie élargit considérablement la méthode de détermination de la structure à haut débit des protéines instables, à faible rendement, de fusion et de fixation du substrat qui ont été difficiles à analyser avec les méthodes conventionnelles.

Des protéines cristallisées dans des cellules vivantes ont été fréquemment rapportées au cours des dernières décennies1,2,3. Ces cristaux assurent des fonctions biologiques telles que le stockage des protéines, la protection, la catalyse hétérogène et l'activation du système immunitaire4. Les relations entre les fonctions et les structures des cristaux ont été étudiées par détermination directe de la structure des cristaux de taille micronique cultivés dans des cellules vivantes depuis que la structure des polyèdres, un cristal naturel dans la cellule, a été déterminée pour la première fois en 20075. Ainsi, la cristallisation dans la cellule de diverses protéines a été largement attendue pour être développée comme un outil de biologie structurale de nouvelle génération car elle ne nécessite pas de procédures de purification et de criblage de cristallisation à grande échelle pour obtenir des cristaux de haute qualité2. En 2013, la structure cristalline de la cathepsine B de Trypanosoma brucei a été déterminée en utilisant la cristallisation des protéines dans la cellule (ICPC) comme premier exemple de détermination de la structure cristalline d'une protéine recombinante6. Depuis lors, l'ICPC a été tenté à plusieurs reprises, mais les structures de quelques protéines seulement ont été rapportées4,7,8,9,10,11. En effet, les cristaux se forment souvent accidentellement dans les cellules et leur taille et leur qualité sont insuffisantes pour l'analyse structurale12. Par conséquent, plusieurs problèmes techniques doivent être surmontés dans l'application de cette méthode pour l'analyse de la structure des protéines.

Plusieurs méthodes ICPC, telles que le criblage à haut débit et l'optimisation des processus de culture cellulaire, ont été développées dans le but de résoudre ces problèmes13,14,15. Un pipeline contenant la cristallisation de protéines à l'aide de cellules d'insectes avec tri par cytométrie en flux a été développé15. Le groupe de LaBaer a construit un ensemble de vecteurs d'expression de baculovirus pour une expression parallèle à grande échelle de protéines dans des cellules d'insectes et a préparé avec succès des microcristaux14. Les cellules de mammifères et d'insectes, actuellement utilisées pour l'ICPC, continuent de représenter une limitation importante en tant que plates-formes pour produire rapidement un grand nombre de microcristaux de haute qualité. Bien qu'une autre tentative ait été faite pour ajouter des réactifs chimiques utilisés pour la cristallisation in vitro, cela n'a pas conduit à des améliorations de l'ICPC, peut-être parce que l'efficacité avec laquelle les réactifs pénètrent dans les membranes cellulaires et leurs effets sur d'autres fonctions cellulaires sont inconnus12. Les bactéries Bacillus thuringiensis (Bt) ont été utilisées pour exprimer par recombinaison des protoxines cry comme vaisseaux de cristallisation pour les protéines cargo, mais les structures n'ont pas pu être déterminées16,17. Une fois qu'un nouvel ICPC aura été établi et intégré aux méthodes de cristallisation in vitro pour surmonter ces préoccupations concernant l'ICPC, cette méthode devrait devenir une technologie plus accessible pour l'analyse de la structure.

La synthèse protéique acellulaire (CFPS), une technique de préparation des protéines utilisée en biologie synthétique, est très efficace pour le criblage rapide de la synthèse protéique18. Cependant, il a été considéré comme inadapté aux efforts de biologie structurale qui nécessitent de grandes quantités de protéines, telles que la cristallisation19,20,21. Ici, nous rapportons l'application du CFPS à l'ICPC (Fig. 1). Nous nous concentrons sur (1) l'établissement de la cristallisation des protéines à l'aide de CFPS avec des réactions rapides et à petite échelle et (2) la manipulation de la cristallisation en ajoutant des réactifs chimiques. Le cristal de polyèdre (PhC) produit dans les cellules d'insectes par infection de cypovirus (virus de la polyédrose cytoplasmique, CPV) est l'un des cristaux de protéines intracellulaires les plus étudiés. Nous avons obtenu des PhC de taille nanométrique dans une réaction de 200 μL en 6 h. Nous avons déterminé la structure de la protéine à haute résolution à l'aide d'une ligne de lumière standard actuelle (BL32XU) à SPring-8, une grande installation synchrotron. Le PhC cristallisé dans une échelle de réaction de 20 μL a été analysé avec succès à 1,95 Å.

( a ) Illustration schématique de la cristallisation des protéines acellulaires (CFPC) du monomère de polyédrine (PhM) à l'aide du kit de synthèse des protéines de germe de blé. (b) Photographie du tube après CFPC. ( c ) Image de contraste interférentiel différentiel (DIC) de PhC_CF. Barre d'échelle 10 μm. ( d ) Une micrographie électronique à balayage de PhC_CF. Distribution de taille de PhC_CF déterminée par l'image SEM. Barre d'échelle 1 μm.

L'avantage le plus crucial du CFPC est que divers réactifs peuvent être ajoutés au mélange réactionnel sans empêcher la synthèse des protéines. La structure de la protéine d'inclusion cristalline A (CipA), un cristal bactérien dans la cellule, n'avait pas été rapportée auparavant22. Puisque nous avons découvert que des cristaux jumeaux se forment lorsque CipA est exprimé dans E. coli, nous avons appliqué le CFPC à CipA avec l'ajout d'inhibiteurs de cristaux jumeaux pendant le processus de cristallisation et avons réussi à obtenir des cristaux appropriés et à déterminer la structure de CipA à une résolution de 2,11 Å. Par conséquent, le CFPC, une méthode hybride d'ICPC et de cristallisation de protéines in vitro, peut être développé à une échelle étonnamment petite pour fournir une cristallisation rapide sans aucune procédure de purification. Le CFPC ouvre une nouvelle méthode pour cristalliser des protéines instables et déterminer rapidement leurs structures.

Le CFPS est une méthode conventionnelle de biologie synthétique pour la détermination structurale des protéines21. Il permet la synthèse de protéines, telles que les protéines membranaires et les assemblages de protéines, difficiles à purifier à l'aide de cellules vivantes23,24. Nous avons réalisé CFPS en utilisant des extraits de germe de blé car ces extraits ont été identifiés comme ayant l'activité d'expression protéique la plus élevée parmi les systèmes eucaryotes25. La cristallisation du monomère de polyhédrine (PhM) a été réalisée à l'aide du kit de synthèse des protéines de germe de blé (WEPRO®7240 Expression Kit). La réaction de traduction a été réalisée en utilisant la méthode bicouche. Un mélange réactionnel de 20 μL contenant 10 μL de WEPRO®7240 et 10 μL de la solution d'ARNm a été recouvert d'une solution SUB-AMIX® SGC de 200 μL dans un microtube de 1,5 mL, puis incubé à 20 °C pendant 24 h. Des précipités blancs ont été recueillis après centrifugation de la solution réactionnelle (Fig. 1b). Le précipité cristallin a été observé au microscope optique (Fig. 1c). La SDS-PAGE et la spectrométrie de masse à temps de vol par ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) du précipité ont montré une bande à 28 kDa et un pic de 28 361 Da, respectivement (Fig. 1 supplémentaire). Ces résultats sont cohérents avec le poids moléculaire calculé du PhM (28 368 Da). Les cristaux préparés à partir de la réaction CFPC (PhC_CF) ont la même morphologie cubique que celle du PhC synthétisé dans les cellules d'insectes (PhC_IC). La taille moyenne de PhC_CF (580 nm) est d'environ un cinquième de celle de PhC_IC (2700 nm) telle que déterminée par microscopie électronique à balayage (SEM) (Fig. 1d, Fig. 2 supplémentaire).

Pour clarifier la dépendance temporelle de la formation de PhC_CF, la réaction de cristallisation induite par CFPC a été surveillée à 0, 5 h, 1 h, 1, 5 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h et 24 h avec SEM. Lorsque PhM a été exprimé à 20 ° C, les cristaux cubiques ont été observés pour la première fois 2 h après le début de la réaction de traduction (Fig. 2). Les tailles moyennes des cristaux mesurées après 2 h, 4 h, 6 h, 12 h et 24 h se sont avérées être respectivement de 340 nm, 400 nm, 400 nm, 470 nm et 580 nm. Aucun cristal n'a été observé au MEB après 1,5 h de réaction. Lorsque l'expression de PhM a été confirmée par SDS-PAGE à 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2,0 h, 3,0 h et 4,0 h après la réaction de traduction à 20 ° C, une bande correspondant à PhM a été observée après 1 h, mais la bande n'a pas été observée à 0,5 h (Fig. 3 supplémentaire). Ces résultats indiquent que des quantités insuffisantes de PhM pour la cristallisation sont obtenues après 1,5 h.

CFPC dépendant du temps de PhC_CF. Images SEM et histogrammes de taille du PhC_CF purifié après traduction à 20 ° C pendant (a) 2 h, (b) 4 h, (c) 6 h, (d) 12 h et (e) 24 h. ( f ) Taille des cristaux de PhC_CF purifié au fil du temps. Barres d'erreur = SD. Barres d'échelle 1 μm.

Pour évaluer la dépendance à la température de la formation de PhC_CF, les réactions de traduction ont été réalisées à différentes températures. Après 24 h, les cristaux se sont formés avec des tailles moyennes de 330 nm, 390 nm, 450 nm, 580 nm et 1170 nm à 4 ° C, 10 ° C, 15 ° C, 20 ° C et 25 ° C, respectivement (Fig. 3). À 15 °C et 25 °C, des cristaux cubiques ont été observés, mais de nombreux cristaux ronds ont été observés à 4 °C et 10 °C. Bien que l'on s'attende à ce que la température de réaction affecte l'efficacité de l'expression, les rendements en PhM après 24 h ne différaient pas significativement dans la plage de température de 10 à 20 ° C, comme le confirme SDS-PAGE (Fig. 4 supplémentaire). Le SDS-PAGE de la solution de réaction après CFPC, la solution surnageante après centrifugation et les cristaux purifiés pour comparer les quantités de PhM dans PhC et restant dans la solution ont montré qu'environ 70 à 80% des PhM forment des PhC à 10–20 ° C, mais les rendements étaient inférieurs à 4 et 25 ° C (Fig. 4 supplémentaire). Par conséquent, la taille et la morphologie des cristaux devraient être affectées par la quantité de PhM cristallisé et la vitesse de cristallisation à diverses températures.

CFPC dépendant de la température de PhC_CF. Images SEM et histogrammes de taille du PhC_CF purifié après traduction à (a) 4 °C, (b) 10 °C, (c) 15 °C, (d) 20 °C et (e) 25 °C pendant 24 h. ( f ) Taille des cristaux de PhC_CF purifiés en fonction de la température. Barres d'erreur = SD. Barres d'échelle 1 μm.

Pour collecter les données de diffraction des PhC_CF de taille nanométrique, les cristaux isolés du mélange réactionnel ont été diffractés à l'aide du faisceau de micro-rayons X de la ligne de lumière BL32XU équipée de la cristallographie par rotation synchrotron série (SS-ROX) à SPring-8 (Fig. 5 supplémentaire) 26,27. PhC_CF obtenu après 24h à 20°C (PhC_CF20°C/24h) a été affiné avec une résolution de 1,80 Å, et a un groupe d'espace (I23) et des paramètres de réseau qui sont essentiellement identiques à ceux de PhC_IC (PDB ID : 5gqm) (Tableaux 1, 2). La valeur de l'écart quadratique moyen (RMSD) des atomes Cα pour la structure de PhC_IC est de 0, 09 Å (Fig. 4a). La principale différence entre PhC_CF20 ° C / 24 h et PhC_IC est que PhC_CF20 ° C / 24 h ne montre aucune densité électronique des nucléotides triphosphates (NTP) liés à l'interface monomère, qui sont observés dans PhC_IC (Fig. 4b – e). Les valeurs moyennes du facteur B par résidu de tous les atomes dans PhC_CF20 ° C / 24h montrent une valeur élevée pour His76 en raison du manque de cytosine triphosphate (CTP) interagissant avec His76 dans PhC_IC (Fig. 4b, d, Supplémentaire Fig. 6). Dans PhC_IC, les résidus d'acides aminés entourant la guanine triphosphate (GTP) et l'adénosine triphosphate (ATP) interagissent avec les NTP, mais dans PhC_CF20°C/24h, qui n'a pas ces densités électroniques, il n'y a pas de différence significative dans la conformation de la chaîne latérale entre PhC_CF20°C/24h et PhC_IC (Fig. 4b – e). Ces résultats indiquent que la liaison NTP n'est pas essentielle pour la cristallisation de PhM.

Comparaison de la structure cristalline entre PhC_CF20°C/24h et PhC_IC (PDB ID : 5gqm)28. (a) Structures superposées de PhC_CF20°C/24h (vert) et PhC_IC (magenta). (b,c) Vues rapprochées des sites de liaison (b) CTP et (c) ATP/GTP dans PhC_CF20°C/24h, (d,e) Vues rapprochées des sites de liaison (d) CTP et (e) ATP/GTP dans PhC_IC. Le 2|Fo| sélectionné − |Fc| les cartes de densité électronique à 1,0σ sont présentées en bule. Les liaisons hydrogène sont indiquées par des lignes pointillées jaunes.

Les cristaux formés avec le CFPC dans diverses conditions ont fourni des ensembles de données adaptés à l'analyse structurale (tableaux 1, 2, 3). Les structures cristallines ont été affinées avec une plage de résolution de 1,80 à 2,50 Å. Les valeurs RMSD des atomes Cα de PhC_IC sont inférieures à 0,29 Å, ce qui indique que la structure globale de PhC_IC est conservée dans PhC_CFs. Bien qu'aucun ensemble de données n'ait été obtenu pour les cristaux formés à 20 ° C pendant 2 h et 4 h, et à 4 ° C et 10 ° C pendant 24 h en raison de moins d'images indexées, nous avons obtenu un ensemble de données pour PhC_CF20 ° C/6h avec une résolution de 2, 50 Å (tableaux 1, 2, 3). La résolution a été améliorée lorsque le temps de réaction a été augmenté de 6 à 24 h. Cette amélioration de la résolution est probablement attribuée à une augmentation des images indexées en raison de la plus grande taille des cristaux (Fig. 2f). Ces résultats montrent que la réaction CFPC de PhC dans des conditions optimisées produit avec succès des nanocristaux de qualité suffisante pour obtenir une structure à haute résolution en seulement 6 h. Ce temps de réaction est considérablement réduit par rapport au temps de culture (> 3 jours) nécessaire pour obtenir des cristaux comparables de haute qualité en utilisant des cellules d'insectes15.

L'une des caractéristiques les plus critiques du CFPC est la minimisation de l'échelle de réaction. La réaction a été réalisée en dialysant un mélange de WEPRO®7240 (5 μL), de la solution d'ARNm (5 μL) et de 10 μL de SUB-AMIX® SGC contre 1,0 mL de SUB-AMIX® SGC. Après 24 h à 20 °C, des cristaux (PhC_CF20μL_20°C/24h) ont été collectés. La taille moyenne de PhC_CF20μL_20°C/24h était de 610 ± 150 nm, ce qui est essentiellement identique à la taille moyenne de PhC_CF20°C/24h (Fig. 7 supplémentaire). L'analyse structurale du PhC_CF20μL_20°C/24h obtenu avec une échelle de réaction de 20 μL par SS-ROX a donné un jeu de données de résolution de 1,95 Å, comparable à celles du PhC obtenu avec une échelle de 220 μL (Tableaux 1, 2, 3).

Après avoir validé avec succès le CFPC dans la cristallisation de PhC, nous avons appliqué cette méthode pour surmonter les défis actuels dans la détermination de la structure de CipA car elle offre la possibilité d'ajouter des composés chimiques lors de la cristallisation. La protéine d'inclusion cristalline A (CipA), une protéine hydrophobe de 104 résidus d'acides aminés, forme spontanément des agrégats cristallins chez Photorhabdus luminescens, une bactérie entomopathogène29. Sa fonction native est supposée être impliquée dans la symbiose ou la pathogenèse des nématodes30. Il peut également former une agrégation cristallisée dans E. coli, qui est utilisée comme matrice pour la construction de nanomatériaux solides. Sa structure n'a pas encore été déterminée22. Des cristaux CipA formés dans E. coli (CipAC_EC) d'une taille moyenne de 410 ± 80 nm ont été diffractés avec une résolution de 2, 8 Å en utilisant la méthode SS-ROX sur la ligne de lumière BL32XU de SPring-8 (Fig. 8a, b supplémentaires, Tableaux 4, 5). Cependant, nous n'avons pas pu trouver de solution MR lors de l'utilisation du modèle AlphaFold2 (AF2) prédit31. Cela est dû à la grande fraction de jumeaux de 0,42 (tableau 4). Ensuite, nous avons tenté de déterminer la structure de CipA en réduisant la fraction de macles à l'aide de CFPC. Lorsque CipA a été exprimé par CFPC avec la méthode de dialyse32, un précipité blanc est apparu dans le mélange de solution après 24 h (Fig. 8c supplémentaire). L'image SEM et le MALDI TOF – MS du précipité ont montré que le précipité est le cristal CipA (CipAC_CF) avec une taille moyenne de 3400 ± 880 nm (Fig. 8d, e supplémentaire). C'est huit fois plus grand que la taille de CipAC_EC. L'analyse structurelle de CipAC_CF a été tentée avec des données d'une résolution de 1, 61 Å obtenues en utilisant la méthode du petit coin à BL32XU de SPring-827. Cependant, la structure n'a pas pu être déterminée car la fraction de macles était encore trop élevée (0,42), comme c'est le cas dans E. coli. Pour surmonter le problème de jumelage survenant dans les cristaux de haute qualité, nous avons reconnu que la méthode CFPC permet l'ajout de réactifs qui inhibent le jumelage, tels que l'éthanol, le 1,4-dioxane, les PEG, le Dextran et le TEG33,34. Les images SEM montrent que les CipAC_CF cristallisés en présence d'additifs ont des tailles légèrement plus grandes ou similaires et des formes similaires par rapport aux CipAC_CF cristallisés en l'absence d'additifs (Fig. 9 supplémentaire). Cela indique que la méthode CFPC peut être étendue pour inclure diverses manipulations chimiques sur les cristaux, ainsi que l'ajout de composés chimiques et de protéines sur les cristaux et les protéines au cours du processus de croissance des cristaux.

Des expériences de diffraction des rayons X des cristaux ont montré que le CipAC_CF cristallisé en présence de 3 % v/v de 1,4-dioxane réduit considérablement la fraction de macles à 0,10, avec une résolution de 2,11 Å (Tableau 4, 5). Le cristal est tétragonal, avec un groupe d'espace I4 ayant des paramètres de cellule unitaire a = b = 60,1 Å, c = 54,0 Å, α = β = γ = 90° (tableaux 4, 5). La structure a été déterminée par la méthode de remplacement moléculaire en utilisant le modèle de recherche créé par AF231 via ColabFold35. La structure du monomère CipA se compose du bras N-terminal suivi de trois brins β β1, β2, β3, α-hélice et β-brins β4 et β5. À l'exception du bras N-terminal, le domaine globulaire est un pli typique de liaison oligonucléotide/oligosaccharide (OB) (Fig. 5a). Les structures de Met1-Asn3 et Asp12-Val19 à l'extrémité N-terminale n'ont pas pu être déterminées en raison de la chance de la densité électronique. Dans le réseau cristallin, les quatre hélices α de chaque monomère forment un faisceau de quatre hélices autour de l'axe de symétrie cristallographique quadruple et existent sous forme de tétramère. Ce tétramère est cohérent avec les résultats de la prédiction PISA36 des états oligomères et est considéré comme l'unité de base de la croissance cristalline. En ce qui concerne les interactions entre les monomères du tétramère, des liaisons hydrogène (Nδ/Asn62i–O/Leu59ii, Nδ/Asn62i–O/Leu60ii, Nδ/Asn62i–Oδ/Asn62ii, O/Ala66i–Oζ/Tyr68ii et O/Met104i–Nζ/Lys78ii) se forment entre chaque hélice (Fig. 5b). De plus, les brins β1 et β5 de la molécule voisine forment un nouveau feuillet β avec des liaisons hydrogène (Nζ/Lys56i–Oδ/Asp34ii, Nδ/Asn98i–Oδ/Asp34ii, N/Val100i–O/Val31ii, O/Val100i–N/Val31ii, N/Ile102i–O/Met29ii, N /Ile102i–N/Met29ii et N/Met104i–O/Ile27ii) et le pont salin (Nζ/Lys56i–Oδ/Asp34ii) (Fig. 5b). L'interaction entre les bords de chaque tétramère forme le réseau cristallin de base, et il est encore stabilisé par le bras N-terminal intégré de la molécule de monomère voisine au niveau de la fente créée entre l'interface tétramère-tétramère (N/Asp4i-OδAsp61ii, O/Asp4i-N/Asn58ii, Oδ/Asp4i-Nδ/Asn58ii, N/His6i-O/Lys56ii, Nε/His6i-O/Met37ii, Oγ/Ser8i-Oζ/Tyr96ii et O/Ser8i-Oζ/Tyr96ii) (Fig. 5c).

Structure cristalline du CipAC-CF avec le 1,4-dioxane. La structure de (a) monomère et (b) tétramère. (a) Le monomère CipA est constitué du bras N-terminal suivi de trois brins β β1, β2, β3, hélice α et brins β β4 et β5. (b) les interactions entre les monomères (i, ii, iii et iv) dans le tétramère. ( c ) Structure du réseau et interactions entre tétramères. Les liaisons hydrogène sont indiquées par des lignes pointillées noires.

Une recherche de structures similaires sur le serveur Dali37 montre des protéines contenant le domaine OB-fold, comme prévu. Parmi eux, une sous-unité B pentamérique d'entérotoxine thermolabile de type IIB (ID PDB : 1QB5) d'une bactérie pathogène présentant une similitude structurelle élevée (z-score> 9,0) a été trouvée. Même si l'homologie de séquence était inférieure à 10%, la topologie des monomères de cette protéine et de CipA est très similaire, avec une valeur RMSD de 2,2 Å en atomes Cα équivalents. Bien que ces protéines aient des états d'oligomérisation différents, chaque monomère forme un faisceau d'hélices α autour de l'axe de symétrie central, et les brins β des monomères adjacents forment des feuillets β sur le bord extérieur du complexe (Fig. 10 supplémentaire).

Nous avons réussi à déterminer les structures cristallines de deux types de protéines à haute résolution à l'aide du CFPC. On pense que les ICPC de PhC et de CipA sont influencés par l'environnement complexe des cellules vivantes5,22. Cependant, une comparaison des structures des PhC par l'ICPC et le CFPC suggère que l'encapsulation des NTP dans les PhC n'est pas essentielle à la cristallisation. Pour la cristallisation de CipA, la formation du cristal macle par ICPC pourrait être inhibée par l'ajout de molécules étrangères dans CFPC pour obtenir des cristaux utilisés pour l'analyse structurale. Ces résultats suggèrent que des environnements cellulaires stricts ne sont pas nécessaires à leur cristallisation. Ainsi, en utilisant le CFPC, nous avons pu déterminer les facteurs de cristallisation dans les environnements cellulaires, qui étaient difficiles à étudier par l'ICPC seul. La cristallisation des protéines à l'aide du CFPC indique qu'il existe des possibilités d'obtenir des cristaux de protéines recombinantes car les additifs peuvent contrôler la cristallisation, comme avec la cristallisation in vitro.

Des cristaux de protéines avec des données de diffraction à haute résolution ont été obtenus à partir de petits volumes de réaction et de courts délais CFPC. Le CFPC de PhC nous a permis d'obtenir la structure 2,50 Å pour des cristaux obtenus seulement 6 h après le début de la réaction. ICPC utilisant des cellules d'insectes nécessite trois jours pour obtenir PhC_IC après l'infection virale (tableau 1)15. En effet, les cellules d'insectes impliquent divers processus cellulaires dans la production de la protéine cible. Le système de réaction CFPS est dédié à la production de la protéine cible et des cristaux. De plus, le CFPC utilisant des extraits cellulaires permet la formation de cristaux indépendamment de l'échelle de réaction. En utilisant une petite coupelle de dialyse, non seulement PhC_CF peut être identifié à une échelle de réaction de seulement 20 μL, mais une structure avec une résolution de 1,95 Å a également été obtenue. Ainsi, il a été constaté que le CFPC peut synthétiser efficacement des cristaux de protéines de haute qualité en tirant parti de la plus petite échelle de réaction. Cela fournit une solution au problème des faibles rendements de cristaux de haute qualité produits par l'ICPC et montre un grand potentiel pour faciliter le criblage de cristaux, ce qui n'est pas réalisable en utilisant les méthodes rapportées précédemment et l'ICPC.

La structure cristalline de CipA a été déterminée à haute résolution en ajoutant des réactifs chimiques au mélange réactionnel CFPC. CipAC_CF forme une structure multicouche composée des tétramères comme blocs de construction (Fig. 5). Entre les couches, le N-terminal Asp4-Ser8 interagit avec une autre couche pour stabiliser les cristaux. L'empilement en couches des tétramères forme un espace poreux dans la structure du réseau. La région d'Asp12-Val19, dont la structure modèle n'a pas été déterminée en raison du désordre, devrait être située dans cet espace poreux.

Aucune densité électronique d'autres molécules, y compris le 1,4-dioxane utilisé comme additif, n'a été observée à l'interface de CipA. En plus du 1,4-dioxane, qui est connu pour être un inhibiteur jumeau38, il a été constaté que les PEG réduisaient la fraction jumelle (tableau 4). En particulier, une réduction significative par le PEG400 a été observée. L'effet est supposé être similaire à l'effet fourni par le 2-méthyl-2,4-pentanediol (MPD), plutôt qu'à l'effet de volume d'exclusion du PEG avec un poids moléculaire élevé33. D'autre part, CipAC_EC préparé par l'ICPC a donné des données de diffraction à haute résolution, mais la structure n'a pas pu être déterminée en raison de la fraction de macles élevée (tableau 4). Chez E. coli, un manque de molécules en interaction, telles que le PEG400, à la surface de CipA peut conduire à l'incorporation de tétramères inversés dans la structure cristalline multicouche de CipA_EC, entraînant une grande fraction de jumeaux (Fig. 8 supplémentaire). De cette manière, le CFPC permet de contrôler le processus de cristallisation pour obtenir des cristaux de protéines de haute qualité en ajoutant des réactifs chimiques.

CFPC est utile pour étudier les étapes de cristallisation dans les cellules vivantes. Plusieurs protéines modèles ont été utilisées pour étudier le mécanisme ICPC12. Ces protéines modèles peuvent être cristallisées même dans un environnement intracellulaire riche en impuretés. Ces études suggèrent que d'abondantes protéines endogènes intracellulaires et organites jouent un rôle de précipitants ou d'agents d'encombrement, comme les polyéthylène glycols. De plus, l'ICPC a été tenté en ajoutant un réactif de cristallisation, mais aucun effet caractéristique sur la cristallisation n'a été confirmé12. Étant donné que les réactions intracellulaires induites par ICPC sont complexes, il reste difficile d'identifier les facteurs de cristallisation communs pour les protéines modèles. Dans cette étude, il a été constaté que l'ajout de PEG inhibait le jumelage et favorisait la formation de cristaux de haute qualité de plus grande taille (Figs. 8, 9 supplémentaires). Il a été rapporté que le PEG induit une séparation de phases liquide-liquide (LLPS) dans la réaction de CFPS39. De plus, LLPS joue un rôle important lors de la cristallisation des protéines in vitro40. Ainsi, on en déduit que le LLPS est un facteur impliqué dans la promotion de la cristallisation des polyèdres et du CipA dans la solution CFPC. Une étude détaillée de cette proposition est en cours.

Nous avons établi une méthode CFPC pour obtenir rapidement des cristaux de protéines dans des volumes de microlitres en quelques heures sans procédures compliquées de purification et de cristallisation. De plus, des structures de protéines à haute résolution ont été obtenues à l'aide des nanocristaux. Bien que l'on s'attende à ce que l'ICPC devienne un outil important dans l'analyse de la structure cristalline, des défis cruciaux subsistent car les cristaux ne sont pas formés en quantités et en qualité appropriées pour fournir des structures à haute résolution. Nous avons utilisé le CFPC pour permettre un dépistage rapide des conditions de réaction telles que la température, le temps et les effets des additifs et obtenu la préparation de cristaux de protéines de haute qualité adaptés à l'analyse de la structure. Ces résultats indiquent que le CFPC sera probablement un outil puissant pour l'analyse de la structure cristalline des protéines instables ou à faible rendement, qui sont actuellement considérées comme difficiles à cristalliser à l'aide de méthodes conventionnelles de cristallisation des protéines.

Tous les réactifs ont été achetés auprès de TCI, Wako, Nacalai Tesque, Sigma-Aldrich et Life Technologies et ont été utilisés sans autre purification.

Les morphologies des cristaux purifiés ont été confirmées par microscopie électronique à balayage (MEB). Après avoir remplacé le PBS par de l'eau Milli-Q, les cristaux ont été séchés et observés au SEM. Les analyses SEM ont été réalisées sur JCM-6000 Neoscope (JEOL). Les cristaux de WTPhC et de CipA ne se sont pas dissous dans l'eau Milli-Q5,30.

L'expression et la cristallisation de PhM ont été réalisées à l'aide d'un kit d'expression WEPRO7240 (CellFree Sciences). Le gène de la polyédrine a été cloné dans le vecteur PEU-E01-MCS (CellFree Sciences) pour l'expression de la polyédrine. Le plasmide a été amplifié dans des bactéries DH5α et purifié à l'aide du kit Qiagen Plasmid Midi. La transcription a été réalisée dans des tubes de 1,5 mL selon le protocole du kit d'expression. Après incubation pendant 6 h à 37°C, l'ARNm a été utilisé pour la traduction. Les réactions de traduction ont été réalisées en utilisant la méthode bicouche. 20 μL de mélange réactionnel contenant 10 μL d'extrait de germe de blé WEPRO7240, 10 μL d'ARNm préparé, 40 mg/mL de créatine kinase ont été recouverts de 200 μL de solution SUB-AMIX SGC dans un microtube et incubés à 20 °C pendant 24 h. Les cristaux ont été récupérés par centrifugation et lavés plusieurs fois avec du PBS. La cristallisation dépendante du temps et de la température a été réalisée par le même procédé à l'exception du changement de temps et de température.

Avant la collecte des données, les cristaux ont été immergés dans un tampon PBS contenant 50% d'éthylène glycol, puis récupérés avec un MicroLoops à double épaisseur de 1000 μm (Mitegen), puis congelés dans de l'azote liquide. La diffraction des données des PhC a été collectée à 100 K à l'aide de la ligne de lumière de BL32XU à SPring-8 avec une longueur d'onde de rayons X de 1, 00 Å. L'ensemble de la collecte de données a été automatisé par le système ZOO, y compris le changement d'échantillon par un robot27. La méthode de cristallographie par rotation synchronisée en série (SS-ROX), qui a été développée pour collecter efficacement les données de diffraction des microcristaux, a été utilisée26,41. Un microfaisceau de 1,2 μm (vertical) × 1,0 μm (horizontal) a été utilisé. Les ensembles de données ont été collectés en utilisant une rotation hélicoïdale de 0,25 ° et une translation de 1 μm par image avec une fréquence d'images de 58,824 Hz (~ 2 × 1010 photons/image). L'indexation a été effectuée à l'aide de CrystFEL version 0.6.342 avec Dirax43 et Mosflm44. Le nombre d'images indexées pour PhC_CF20°C/6h, PhC_CF20°C/12h, PhC_CF20°C/24h, PhC_CF15°C/24h et PhC_CF25°C/24h est respectivement de 1 531, 8 754, 12 846, 3 834 et 12 376. Les intensités intégrées ont été fusionnées par process_hkl dans la suite CrystFEL. Les ensembles de données n'ont pas été obtenus pour PhC_CF20°C/2h, PhC_CF20°C/4h, PhC_CF4°C/24h et PhC_CF10°C/4h en raison du nombre réduit d'images indexées (1, 235, 0 et 258, respectivement) (tableau S1). La structure de PhC_CF20°C/24h a été résolue par raffinement de corps rigide avec phenix.refine45 en utilisant la structure précédemment déterminée (PDB ID : 5GQM). Le raffinement de la structure protéique a été réalisé à l'aide de phenix.refine et REFMAC5 dans la suite CCP445,46. La reconstruction a été réalisée à l'aide de COOT47 basé sur 2|Fo| pondéré sigma-A. − |Fc| et |Fo| − |Fc| cartes de densité électronique. Les modèles ont été soumis à une analyse de la qualité lors des différentes étapes de raffinement avec des cartes d'omission et RAMPAGE48.

L'expression et la cristallisation de CipA ont été réalisées avec la méthode de dialyse en utilisant un kit d'expression WEPRO7240 (CellFree Sciences). La réaction de transcription a été effectuée avec la même chose que PhC_CF. Les réactions de traduction ont été réalisées en utilisant la méthode de dialyse. Le mélange réactionnel contenant 20 μL d'extrait de germe de blé WEPRO7240 comprenant 40 mg/mL de créatine kinase, 20 μL d'ARNm préparé et 40 μL de solution SUB-AMIX SGC a été dialysé contre 2,5 mL de solution SUB-AMIX SGC à 20 °C pendant 72 h. Comme pour la cristallisation de CipA avec des additifs, le mélange réactionnel contenant 16 μL d'extrait de germe de blé WEPRO7240 comprenant 40 mg/mL de créatine kinase, 16 μL d'ARNm préparé, 16 μL d'additif de concentration appropriée et 32 ​​μL de solution SUB-AMIX SGC a été dialysé contre 2,5 mL de solution SUB-AMIX SGC comprenant des additifs à 20 °C pendant 72 h . Les concentrations d'additifs dans le mélange réactionnel et la solution de dialyse étaient de 3 v/v %, 3 v/v %, 1 v/v %, 1 w/v %, 2 w/v % et 1 v/v % pour EtOH, Dioxane, PEG400, PEG3350, PEG8000, Dextran et TEG, respectivement. Les cristaux ont été récupérés par centrifugation et lavés plusieurs fois avec du PBS.

Avant la collecte des données, les cristaux ont été immergés dans un tampon PBS contenant 50% d'éthylène glycol, puis chargés sur les MicroLoops (Mitegen), puis congelés dans de l'azote liquide. Les données de diffraction des CipAC ont été collectées à 100 K à l'aide de la ligne de lumière de BL32XU à SPring-8 avec une longueur d'onde de rayons X de 1, 00 Å. Les positions des cristaux dans une cryo-boucle ont été identifiées par un balayage raster à faible dose. Les ensembles de données complets ont été obtenus en fusionnant plusieurs ensembles de données à petits coins (10 ° chacun) collectés à partir de monocristaux. Les ensembles de données collectés ont été automatiquement traités et fusionnés par KAMO49. Chaque ensemble de données a été indexé et intégré à l'aide de XDS50. Les ensembles de données ont été soumis à un regroupement hiérarchique par un coefficient de corrélation par paires des intensités. Les ensembles de données de chaque cluster ont été mis à l'échelle et fusionnés à l'aide de rejets de valeurs aberrantes mis en œuvre dans KAMO. Les groupes avec le CC1/2 le plus élevé ont été choisis pour les analyses en aval. Le jumelage a été analysé avec phenix.xtriage51. La structure a été résolue par remplacement moléculaire avec Phaser-MR51 de la suite PHENIX en utilisant la structure prédite par AlphaFold231. La reconstruction a été réalisée à l'aide de COOT47 basé sur 2|Fo| pondéré sigma-A. − |Fc| et |Fo| − |Fc| cartes de densité électronique. Les modèles ont été soumis à une analyse de la qualité lors des différentes étapes de raffinement avec des cartes d'omission et RAMPAGE48.

Les coordonnées atomiques de PhC_CF20°C/24h, PhC_CF20mL_20°C/24h et CipAC cristallisé avec 3% de 1,4-dioxane ont été déposées dans la Protein Data Bank sous le code 7XHR, 7XWS et 7XHS, respectivement. Toutes les autres données ou sources sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

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Nous remercions la division d'analyse de Suzukakedai et le département technique de la division d'analyse des biomatériaux de l'Institut de technologie de Tokyo pour nous avoir aidés à effectuer les mesures correspondantes. Des expériences de rayonnement synchrotron ont été menées sous l'approbation de 2019B2561, 2020A2541, 2021A2541 et 2021B2744 à SPring-8. Cette recherche a été partiellement soutenue par le projet de plate-forme pour soutenir la découverte de médicaments et la recherche en sciences de la vie (base pour soutenir la découverte de médicaments innovants et la recherche en sciences de la vie (BINDS)) de l'AMED sous le numéro de subvention JP21am0101070 (numéro de support 1854).

Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant Nos. JP19H02830, JP22H00347, et Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Molecular Engines" (JP18H05421) à TU et JP18K05140 à SA, et Adaptable and Seamless Technology Transfer Program through Target-driven R&D (JPMJTR20U1) from the Japan Science and Technology Agency to TU Ce travail a été soutenu par la subvention SUNBOR de la Fondation Suntory pour les sciences de la vie à MK

Keitaro Yamashita

Adresse actuelle : MRC Laboratory of Molecular Biology, Francis Crick Avenue, Cambridge, CB2 0QH, Royaume-Uni

École des sciences et technologies de la vie, Institut de technologie de Tokyo, Nagatsuta-cho 4259, Midori-ku, Yokohama, 226-8501, Japon

Satoshi Abe, Junko Tanaka, Mariko Kojima, Shuji Kanamaru, Ayako Kobayashi & Takafumi Ueno

Unité d'instrumentation des sciences de la vie SR, Centre RIKEN/SPring-8, 1-1-1, Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo, 679-5148, Japon

Kunio Hirata et Keitaro Yamashita

International Research Frontiers Initiative (IRFI), Tokyo Institute of Technology, Nagatsuta-cho 4259, Midori-ku, Yokohama, 226-8501, Japon

Takafumi Ueno

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SA et TU ont conçu la recherche. SA, JT, MK, SK, KH, KY et AK ont réalisé les expériences. SA, JT, MK, SK, KH, KY et TU ont analysé les données et discuté des résultats. SA, SK et TU ont écrit le texte principal du manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Satoshi Abe ou Takafumi Ueno.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Abe, S., Tanaka, J., Kojima, M. et al. Cristallisation de protéines sans cellules pour la détermination de la structure des nanocristaux. Sci Rep 12, 16031 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-19681-9

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Reçu : 29 juin 2022

Accepté : 01 septembre 2022

Publié: 03 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-19681-9

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